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1、EGFP基因在基因在pET-28a载体载体内的克隆和表达内的克隆和表达绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白(green-fluorescent protein, GFP) 是从太平洋水母中分离出来的一种荧光是从太平洋水母中分离出来的一种荧光蛋白质蛋白质, 为为238 氨基酸组成的单体氨基酸组成的单体, 分子量约分子量约为为27kD。其野生型其野生型(wild-type GFP)的吸收的吸收/激发峰在激发峰在395 nm , 在在475 nm 有一个次要峰，发射峰为有一个次要峰，发射峰为508 nm。对细胞无毒，用于转基因表达的检测。对细胞无毒，用于转基因表达的检测。绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白(GFP)GFP
2、 GFP 的应用特点：的应用特点：1 1、检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用荧光显微镜甚至肉、检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。2 2、荧光稳定：、荧光稳定：GFP GFP 对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；在照；在pHpH范围在范围在7-12 7-12 之间都能正常发光；对高温、碱、离子除垢之间都能正常发光；对高温、碱、离子除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有
3、较强抗性。3 3、无毒害：、无毒害：GFP GFP 对生活的细胞基本无毒害对生活的细胞基本无毒害, ,对目的基因的功能也没对目的基因的功能也没有影响有影响, ,转化后细胞仍可连续传代。转化后细胞仍可连续传代。4 4、具有共用性和通用性：首先表现在、具有共用性和通用性：首先表现在GFP GFP 的表达几乎不受种属范的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次是围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次是GFP GFP 没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。光。5 5、易于构建载
4、体：由于、易于构建载体：由于GFP GFP 分子量较小，仅为分子量较小，仅为27-30kD27-30kD，编码编码GFPGFP的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒。的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒。6 6、可进行活细胞定时定位观察。于得到突变体。、可进行活细胞定时定位观察。于得到突变体。关于关于EGFPEGFP蛋白蛋白pEGFP-N3pEGFP-N3质质粒粒编编码码EGFPEGFP蛋蛋白白，它它是是野野生生型型绿绿色色荧荧光光蛋蛋白白（wtGFPwtGFP）经经克克隆隆技技术术改改造造而而成成的的遗遗传传突突变变体体。它它有有两两个个氨氨基基酸酸的的
5、替替换换，即即 PhePhe2 26464Leu Leu 和和 SerSer2 26565ThrThr。用用485 485 nmnm光光激激发时，EGFPEGFP可可以以产生生比比wtGFPwtGFP 强强 35 35 倍倍的的荧光光。另另外外，EGFPEGFP具具有有红红外外转转换换激激发发光光谱谱（red-shifted red-shifted excitation excitation spectraspectra），而而且且能能在在哺哺乳乳动动物物细细胞胞内内得得到到高水平表达。高水平表达。质粒质粒pEGFP-N3图谱图谱表达载体表达载体pET-28apET表达体系是在大肠杆菌中克隆和表达融表达体系是在大肠杆菌中克隆和表达融合蛋白常用的体系之一。合蛋白常用的体系之一。使用使用T7Lac启动子；启动子；BamHI下游存在转录终止信号；下游存在转录终止信号；含有寡聚组氨酸链（含有寡聚组氨酸链（His-tag),便于融合蛋白便于融合蛋白的纯化。的纯化。表表达达载载体体pET-28a图图谱谱
