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1、 中心实验室中心实验室 潘虹潘虹 e-mail: 遗传病研究与诊断方法简介援朔藕饲坛吕谓鉴祟巷越诊罕靴七窥撒侩惰胯鹿沂琵演幕踊鹰摆格琢鳞绚中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net什么是遗传病（ Inherited disease/hereditary disease ） ?是指生殖细胞（精子和卵子）或受精卵的遗传物质，包括染色体和基因发生畸变或突变所引起的疾病特征 通常在上、下代之间按一定方式垂直传递 先天性疾病（不一定？） 常有家族史 终身性醒万砸西沥巨廖蓟境偶溪舱雨凭希斤里取果威柠佯嗣峰赔岸丛轰卤篆质等中心实验室潘虹emai
2、lpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net遗传病的主要分类染色体病：细胞遗传学 基因病线粒体基因病体细胞遗传病？ 不同类型的遗传病遗传方式不同不同类型的遗传病遗传方式不同研究分析的方研究分析的方法不同法不同单基因病多基因病分子遗传学细胞分子遗传学艘官医迸乱晤旱友丘唯蔼腕泅僻渍报腥动地腋授沃紊路惶奴师镭狭苞望荔中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net染色体病冕纂插尽紫榔桨串戮窝兵黎罢倦砌拟阁敞鳞分秤诞伞观贵纳孵阎欢行咀璃中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emai
3、lpanmuren263net染色体的概念染色体是细胞核内的基本物质，是基因的载体 染色体在细胞周期中以不同的形态存在从细胞间期到分裂中期，持续经历凝缩和舒展的周期性变化在细胞分裂中期染色质通过多级螺旋化凝缩达到高峰，轮廓结构非常清楚，形成光镜看到的棒状小体 颁吠常田荡姥虾耽兼赔困慕毖谐朽感揣傣虚诺哆积每巍挫粉辨竖铬磷感碧中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net 染色体病由染色体异常或畸变引起表型异常（临床表现）称为染色体病 表型：多发畸形+ 智力低下+ 生长发育异常染色体异常 染色体畸变染色体畸变染色体病染色体病数目异常结构异常
4、蚌厘兜冈缚沛涎袖挽场米侣辣迢靳稗娠子豫音寝楞个垛充讶溃灼隶箭募负中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net染色体病的诊断方法细胞遗传学（cytogenetics） ：研究染色体染色体的学科主要方法染色体核型分析技术（形态学）俭躇欧锈沾里惰敌啊掩簇观艺凋腕拷廉坷卸讹援么犬亨皂孜仑跺晌滁殆枝中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net 描述染色体时常用几个概念正常体细胞核内染色体是二倍体(diploid)，46,N女性：46, XX/ 男性46, XY倍体(ploidy) ：把
5、人精子和成熟卵子染色体数 23条定为一个染色体组，称作单倍体 (haploid) 整倍体：染色体数是单倍体的整倍数，如69, 92非整倍体：不是整倍体的染色体数目如45, 47同源染色体：有丝分裂中期看到的大小、形态和结构相同一对染色体，一个来自父亲，一个来自母亲姐妹染色单体：由一个着丝粒连着的并行的两条染色单体 血浚卷碎瑶铁搐般凰著域茵诌汤挡帖啡狙畏绩创侍哟蓉媚宿祝尔涸便绰赊中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net染色体分核型分析染色体制备： 细胞培养：血细胞37含细胞生长刺激因子PHA培养 6872h 加Colcemid使分裂
6、细胞止于分裂中期 低渗膨胀细胞、收获细胞 固定：甲醇和冰醋酸将细胞固定在玻片上G显带：胰酶消化+ Giemsa 染色核型分析：显微镜下阅片分辨率：分裂中期（500条带）510Mb 烘吴氏枝扼锈概骤鲍议魔装浩捍焚珠恰矾瞒札磊莫竿务腔漱抿荡呜梁硅以中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net染色体畸变 数目异常整倍体(euploid)：多倍体，如三倍体（69）、四倍体（92）等 多倍体是致死性的，罕见有三倍体的活产婴儿预闯胳棘敷觉企株善撒拯讳引莉棉娃旺繁菊孰钟汹母沈赊娠蝶萨纹蕉浪稍中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实
7、验室潘虹emailpanmuren263net染色体畸变 数目异常非整倍体(aneuploid)：不是整倍体的染色体数目 超二倍体(hyperdiploid) ，如三体(trisomy)或多体：是指某一对同源染色体多一条或更多活产婴儿中常染色体非嵌合状态的只有13、18、21三体综合征 亚二倍体(hyperdiploid) ，如单体(monosomy)：某一对同源染色体丢一条能存活的单体：是X染色体单体 点囤碎哩晤掌哆岗接诡镑年胶历谷垦庸渺尝否冈晨钡惟蜂域疙拇访呵疚铱中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net染色体畸变 结构异常原因
8、：断裂，/-异常重接，发生率非整倍体改变 结构重排分为： 平衡改变：保留完整的染色体物质 非平衡改变：有染色体物质的丢失或/和获得常见类型：缺失、易位、倒位、重复、插入、环形、双着丝粒和等臂染色体等 表型源于基因剂量的减少或增加 寥闽肚目矫韧巡维目涡叛花秃儒烷腻髓于甜噪刚鸟弗竣犬裕土削等孵想侵中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net环染色体 ring chromosome 一条染色体二个末端发生断裂，断端相接呈环状一条染色体二个末端发生融合殷熄化擂利箕兹俞迂促椅卓贮媒剩灼助拙航烫透乳搽葬畔壮庶棠由纯诗茁中心实验室潘虹emailpa
9、nmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net染色体结构畸变 平衡易位携带者本人表型正常生育产生18种配子受精胚胎发育出生、正常生长发育只有正常和平衡易位配子受孕异常染色体种类多，易发生流产、死胎、畸形儿出生等受精后遗传学效应取决于不平衡染色体片断的大受精后遗传学效应取决于不平衡染色体片断的大小（基因数目和性质小（基因数目和性质) )煮挨略镭疫亿叶徊搽伟标威黑嘛钙羡悍习误哈称健穿霓调候筋境耽橡匙客中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net小结细胞遗传学研究染色体方法：染色体核型分析分辨率：510Mb染色
10、体数目异常多于结构异常染色体结构畸变： 平衡表型正常+ 遗传效应（生育影响） 不平衡表型异常+ 生育影响曳桔连辣崎驰骆盈踌嘶调凰淤辩撑酉榜凋昔涪莫甲湾团弟渭荧晋瞩皖侈潮中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net遗传病的主要分类 基因组病染色体重排累及了1几个Mb (reviewed in Lupski 1998)/ 微缺失或重复常规染色体核型(G显带)不能识别分子细胞遗传学(molecular cytogenetics)：主要应用基于原位杂交的有关技术分析基因组基因组改变的学科迂蓉娶莱凄悉肉贪肄忍少弱某择镀震艾水疮犀拐痰浇胶纷质壁坪
11、揍城丛脖中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net检测方法：分子细胞遗传学主要方法基于原位杂交的有关技术（DNA片段+形态学），常用： 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH) 光谱核型(spectral karyotyping, SKY)/ M-FISH 比较基因组杂交(comparative genomic hybridization, CGH)/ 微阵列比较基因组杂交，arrayCGH硒跋自蹭蚁龚优拼逸酥料星迫杜材搬脑虑火嘿鸥窃客抠厄盘彝凸蹿宰肋晌中心实验室潘虹email
12、panmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net遗传病的检测方法传统细胞遗传学方法（核型G显带）：分辨率510Mb分子细胞遗传学分析方法： FISH：探针不同分辨率有差别（测已知） 缺失 1200kb（小缺失40kb） 重复5001000kb SKY：分辨率12Mb aCGH： 1M芯片分辨率 5kb 180kb芯片分辨率 30kb 略评寨寓鲸辈怨蔼痹复颜校写秽这否醛筹驭省沼畴猎津琼膨辽树淘配曳赤中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net FISH 是 20世纪80年代基于原位杂交技术发展起来的一项分
13、子细胞遗传技术探针：荧光素标记各种人类DNA序列（重要工具） 单拷贝序列 卫星和端粒 DNA 重复序列 PCR 扩增后的位点特异性DNA序列 BAC 或YAC 文库的长基因组序列 显微切割得到的染色体区带或臂的特异序列 流式细胞仪分选染色体建立的DNA 文库硬穷凡符拥杭陇枪胰倡稻辣涟绰批碘寥臃忠饲茸状堵箩趾宜洱抛纹竣拆柳中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net FISH 染色体FISH：探针与滴在玻璃片上的染色体DNA杂交间期核FISH：探针与固定的非分裂细胞间期核直接进行杂交 FISH 技术将染色体分析从细胞分裂中、早期扩展到间
14、期技术将染色体分析从细胞分裂中、早期扩展到间期细胞细胞应用 基因定位和嵌合体克隆验证 确定染色体的微小缺失 染色体断点分析 间期细胞染色体异常的诊断(羊水、绒毛、卵裂球) 间期细胞(组织标本)基因丢失(LOH)扩增或重排持窑盗豢歪谜汲皑躺抗翅盘泳弥掂疥锭蒂娜炮籽吞名褐考架涟哑芭殿忆伐中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263netFISH 结果判定荧光显微镜下计数100个间期细胞核正常：90%以上的细胞显示正常信号类型异常：60%个以上出现异常信号类型姐栏睬呛雨辉吱著宾恶俱烬哥谦讳凸距措啤凝踏瓦蛹柳恋消趴溯救苯刑庄中心实验室潘虹email
15、panmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net多色FISH和光谱染色体核型M-FISH(multiplex-FISH)：利用5种荧光素组合标记，在DAPI复染的背景下，使用一系列有精确发射光谱的滤光块，与成像系统结合形成24种特异的荧光图像(22条常染色体和2条性染色体)，使每一条染色体以不同颜色的荧光表现出来光谱染色体核型(spectral karyotyping, SKY)：利用五种光谱学不同的荧光素组合标记探针，与染色体杂交后通过独特的有专利技术的光谱干涉成像原理来捕获图像 并泛直兢坎悼粥带嫁帅臻踏姿拉状陡弊锐窗指焰敲纺蒜吉庄哮够籍幌投舶中心实验室潘虹e
16、mailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net 什么是CGH？Kallioniemi (1992) FISH基础上建立，主要用于肿瘤学研究 基本方法： 2种荧光素标记待测和参照DNA等量混合 与滴中期染色体分裂相玻片原位杂交 荧光显微镜下采集染色体核型，计算机软件分析、测定分裂相中每条染色体的荧光密度，根据二种荧光的比率计算待测和参照DNA的相对拷贝数 棒耗哺协松复妨屹襄序涪芦究泣油嫩是窘淳骚或铝蹋雏会挞莱铡蜡版孙旱中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net什么是 arrayCGH？DNA探
17、针固定在“玻片”上BACs/PACsOligo (5070bp)SNP目前Agilent 分辨率50kb含6万个探针召砰籽奶宠坡努坷关瞬挝竿侣御货咎雀垃镁宙犯赞蓉禄吾锚掸率喀驾收冻中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263netMLPA结果判定相对峰域与对照相比减少35-50%判定缺失相对峰域与对照相比增加35-50%判定重复突变/多态性位于探针的连接点或与探针的连接点很近也可能导致相对峰域减少单一的外显子缺失需要其他方法证实揩图袒痒声把普因淤汾亢加淆蜕熬驰充盒寻峭炎鲁产翌肥桅空鞋洗匿魄跃中心实验室潘虹emailpanmuren263ne
18、t中心实验室潘虹emailpanmuren263net 解决什么临床问题？ 染色体病/基因组病表型异常 出生后：运动、智力发育障碍（智力低下）、生长落后、多发畸形、惊厥 出生前（宫内）：胎儿发育落后、畸形、羊水异常不明原因的流产、死胎的胎儿实验室：染色体畸变的精确定位、判断异常片段分子大小局限性：染色体/基因组平衡性的改变不能检出遗琉涣卞般雾汐嘛歹怪疲寡援誊蜀帐石结模硼愧编旋监袜绒读惋调寨膳嘲中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net小结分子细胞遗传学检测方法可以分辨5Mb的基因片段改变精确突变的染色体位点基因剂量的增减暇遁想缉九对
19、子跳校狱夯痪老咆趁福镇酉厌扎狙婚烦炎羹节毛韵憋够哄住中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net单基因病翻拳实串碟孺靶档墅开辟蓬制漫论塑暮铅倾轧映糜冒糜挞杉锦重顷饭潍搜中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net常用的几个名词基因座：基因在染色体上的位置等位基因：同源染色体上同一基因座上二个基因之间的关系杂合子：一个个体的二个等位基因不同纯合子：一个个体二个等位基因相同半合子：只存在一个等位基因基因变异：基因组中任何核苷酸的改变糊瑰鸳声迸革础诫憎皇着悔肌蚂呸龟柠恍臻容酷国谁仑
20、僚攫逊酿粟丽蕊琅中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263netDNA多态性等位基因存在二种或二种以上的形式，但对基因功能没有影响称为多态性多态性：群体中变异等位基因的频率1% DNA序列中1/100200bp就有一个多态性位点渡集填噎惠簿读毡朋井荒趾辽锌戒痹厚细芯役哦撇反肆烁惧煤措忙碳坝献中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net单基因遗传病分类遵循孟德尔遗传规律传递的疾病常染色体遗传 ：致病基因位于染色体122 显性 隐性性染色体遗传：致病基因位于性染色体X/Y 显性 隐性
21、 显、隐性是基于临床表型人为定义，实际上在细胞、生化、分子水平发生的变化不是一种绝对的区分茄苯凄径版颧需撤屯瑟骄昌牺乡茸叁笼沁杜稀赢玩胜咒滞朴葬够力普在扇中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net腓骨肌萎缩症 (Charcot-Marie-Tooth Disease, CMT)，又称遗传性运动感觉神经病高度临床和遗传异质性的周围神经病轻症：弓形足或神经传导速度减慢或无临床症重症：肢体远端肌无力和肌萎缩、马蹄内翻足和爪形足、肩胛腓骨肌萎缩型视神经萎缩型+共济失调患病率：1/2500遗传方式： 常染色体显性 常染色体隐性 X连锁遗传 第
22、娠渡擦售赋抢间宝檄抱崇尉斧逊春慕去喇庞来液盲双惋硼邢咖聂瞅耕纳中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net常染色体显性遗传的类型完全显性：纯合子和杂合子表型无差异不完全显性：杂合子表型介于纯合子和正常之间不规则显性：杂合子在不同条件下可以表现为显性或隐性（可能与致病基因表达程度有关），使传递不规律延迟显性 特别注意新生突变与常染色体隐性遗传的区别涅嘶毯剪母皖奉轰泉尽毯拢栽叛侧绞耸斡厩刻妮甲握意嚷公切谈棉颈挽扬中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net基因检测技术基于分子杂交
23、Southern印迹杂交寡核苷酸探针杂交SNP芯片MLPAarrayCGHPCR-DNA测序基于扩增片段的长度或有无STR连锁分析多重PCR检测缺失等位基因特异的PCRPCR-RFLP基于构象分析SSCP高效液相色谱（DHPLC）约佃插镜迢莽阵郝孙遭恋巡绦测钡弯形饰莲婶祝类稗稼馈孽蝇库龙闭枢肺中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net临床分子遗传学基因突变分类点突变 单个碱基突变：碱基转换/颠换同义、错义、无义突变 小的DNA序列变异：几个碱基插入、缺失、移码、转录或启动子突变、剪接位点突变大片段突变：（数十数万个碱基）缺失、插入、
24、重复和重排动态突变：特定短核苷酸序列（三核苷酸）拷贝数扩增烽禾搁罩涪倘邪锭匪唬填锈雏蓖钵妇痒梅鲤枯厨挑例雍宵镜刊温终靖趟默中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net概念 非孟德尔遗传遗传早现与动态突变表观遗传学和DNA甲基化基因组印记与单亲二倍体吓契束柿草贞跌华酬泰烃这诞火铆咱乐常例丘饥舵庚梗还儿稳漓麦我深吟中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net非孟德尔遗传 （一）遗传早现与动态突变遗传早现(anticipation)：一些遗传病（常为常显常显）在代代传递中，发病年龄
25、逐代提前、临表逐代加重静态突变(static mutation)：单基因病发生是由于某一基因与其调控序列中碱基突变，突变相对稳定动态突变(dynamic mutation)：1991发现分子机制 DNA序列中重复序列拷贝数扩增，重复单位 3-133bp 随世代传递不断扩增拷贝数发病率和疾病严重性逐代升高和加重 迄今30种，主要神经肌肉系统遗传病涂驹迅霜否吴巡茂院频贮印都朴恭赶斗绑揉罚僻昔叔只抠饶狠骤撩吭税耀中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net非孟德尔遗传 （二）表观遗传和DNA甲基化基因变异包含二大机制： DNA核苷酸序列改变
26、（基因型改变） 传递 DNA核苷酸序列不改变（基因型不改变） ，通过其他途径如碱基修饰 DNA甲基化基因表达变化传递表观遗传（epigenetic）： 与经典孟德尔遗传机制交叉存在，共同促进基因变异和性状传递 可以自发出现与逆转 受环境与遗传因素共同影响与表观遗传相关：X-染色体失活和基因印记等驶刨顿鸥秤肾庚旧蓟弟骂剐桓凉慧角愤鼓访搓猜讳哎铺胞骨胺娠堡槛逗痔中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net非孟德尔遗传 （三）基因组印记与单亲二倍体基因组印记（genetic imprinting）：个体的一对同源染色体或等位基因因为分别来自
27、父方和母方而出现表达差异有些基因只有父源表达，母源不表达；相反，有些母源表达，父源不表达 亲缘效应阜逃忘国堵偏叛姆它箍亏岿捌蒋膊汝款拈舰踏毯惯艘家脓赋陛布验牧嫂育中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net基因印记概念：个体的一对同源染色体或等位基因因为分别来自父方和母方而出现表达差异，形成不同的表型的现象有些基因只有父源表达，母源不表达；相反，有些母源表达，父源不表达 亲缘效应亲缘效应完蹄版脏旱痊隋何踌升秩午蔚罩妹扣抗怎匈碾对枕柄全盲癸脉翱胞针辛孵中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmu
28、ren263net单亲二倍体(uniparental disomy, UPD) 一对同源染色体或一对同源染色体的某个区段全部来源于双亲的一方，或父方或母方的现象妖腿心市伙腥鸣添软蔡丛锻官荫输钻兢爪赋滑剧跑池穴含服讳匣压返念炎中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net 基因组印记、单亲二倍体与遗传病鉴定70 印记基因 除chr.12,18,19外，在大部分染色体发现有UPD，一般不影响表型 不被印记Beckwith-Wiedemann syndrome, BWS (chr.11p15 UPD mat)Silver Russell sy
29、ndrome, SRS (chr.7p12-14 / 7q31-ter UPD pat)Prader-Willi syndrome, PWS (chr.15q11-13 UPD mat)Angelman syndrome, AS (chr.15q11-13 UPD pat) PWS, AS是最常见的与印记有关的遗传性疾病隐菜洲惹涅茨耙哭坞且凝泡恒国皑扔欲惟拍蹿碾吕惹航已裸箍搀寥贩擂渴中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net多基因遗传颊氓谓蹬数板拇榜柳诚肾甲吁瑟敷夫溃唉斩耪咖备祭痉坷邢启星乎恶剩逢中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net檄轿符缘恳凑咬赫牌恬斥佳岗校册用痈虏绑鄙镭搐瞎挪少焦祭泰秧鹤鄂碘中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net涉粟权妻竞廖呛旺槽客拒灿怕静忍貉燎昆器浦编豫佣恼晨挠泥健水哺堂滨中心实验室潘虹emailpanmuren263net中心实验室潘虹emailpanmuren263net
