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1、细菌分离鉴定实验原理及操作注意事项细菌分离鉴定实验原理及操作注意事项 中国最专业的规模化养殖场健康检测服务机构中国最专业的规模化养殖场健康检测服务机构*细菌分离鉴定实验的意义细菌分离鉴定实验的意义* *建立无菌概念，了解无菌操作建立无菌概念，了解无菌操作* *常规病原菌的分离流程常规病原菌的分离流程* *病原菌分离鉴定实验原理病原菌分离鉴定实验原理* *细菌对药物的敏感性试验细菌对药物的敏感性试验* *细菌学实验操作注意事项细菌学实验操作注意事项 1 2 3意义意义细菌分离鉴定实验超级耐药菌超级耐药菌健康养殖健康养殖确诊疾病确诊疾病诊疗方案诊疗方案建立无菌观念建立无菌观念什么是无菌什么是无菌
2、无菌，指没有活菌的意思，又是生物技术中的一个重要概念。只有在无菌，指没有活菌的意思，又是生物技术中的一个重要概念。只有在培养基、发酵设备等处于无菌的前提下，微生物接种后，才能实现纯培养基、发酵设备等处于无菌的前提下，微生物接种后，才能实现纯种培养，最终得到所需的产品。种培养，最终得到所需的产品。接种方法曲线划线法、分区划线法倾注法、涂布法（细菌计数）斜面接种法（生化鉴定、保存菌种）穿刺培养法（生化鉴定、保存菌种）液体培养基接种法病原菌的分离鉴定病原菌的分离鉴定细菌分离培养细菌分离培养 主要针对性用于临床发病动物组织脏器，粪便中的细菌时对某一种主要针对性用于临床发病动物组织脏器，粪便中的细菌时对
3、某一种细菌的分离，通过分离，使细菌在平板中分散生长，便于观察单个菌细菌的分离，通过分离，使细菌在平板中分散生长，便于观察单个菌落特性，也易挑取单个菌落，进行生化鉴定落特性，也易挑取单个菌落，进行生化鉴定。1.1.基本条件基本条件（1 1）接种用具：棉签、接种环、接种针、酒精灯）接种用具：棉签、接种环、接种针、酒精灯（2 2）培养箱：普通恒温培养箱）培养箱：普通恒温培养箱（3 3）无菌室和超净工作台）无菌室和超净工作台（4 4）培养基：营养琼脂、麦康凯琼脂、）培养基：营养琼脂、麦康凯琼脂、SSSS琼脂琼脂2.2.接种方法接种方法分区划线法分区划线法用棉签先将标本涂布在平板的第一区并作数次划线，再
4、在二、三用棉签先将标本涂布在平板的第一区并作数次划线，再在二、三区依次用接种环划线。区依次用接种环划线。每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。每一每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。每一区域的划分应接触线应接触上一区域的接种线区域的划分应接触线应接触上一区域的接种线2 23 3次，使菌量逐渐减次，使菌量逐渐减少，以形成单个菌落。少，以形成单个菌落。划线完毕，将平板加盖，倒置，以适宜的培养条件培养。划线完毕，将平板加盖，倒置，以适宜的培养条件培养。（2 2）液体培养基接种法（增菌法）液体培养基接种法（增菌法） 用棉签或接种环挑取病料或菌落，在试管壁和液面交界
5、处轻轻研磨，用棉签或接种环挑取病料或菌落，在试管壁和液面交界处轻轻研磨，使菌团混匀在液体培养基中。使菌团混匀在液体培养基中。（3 3）倾注平板法）倾注平板法 主要用于水质（饮水）的细菌计数主要用于水质（饮水）的细菌计数 将灭菌生理盐水适量稀释（通常做将灭菌生理盐水适量稀释（通常做1010-1-1-10-10-4-4稀释）的水质稀释）的水质1ml1ml，置灭，置灭菌平皿内，注入以灭菌溶化并冷却至菌平皿内，注入以灭菌溶化并冷却至5050左右的培养基左右的培养基15ml15ml，混匀，混匀，待冷却后，倒置。于待冷却后，倒置。于3737恒温培养箱中培养后，计数培养基内菌落数，恒温培养箱中培养后，计数培
6、养基内菌落数，乘以稀释倍数，即可算出每毫升被检物的细菌数。乘以稀释倍数，即可算出每毫升被检物的细菌数。大肠杆菌细菌分离大肠杆菌细菌分离黑色带有金属光泽，圆形隆起黑色带有金属光泽，圆形隆起粉红色或深红色、圆形隆起、光滑湿润、粉红色或深红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐；边缘整齐；沙门氏菌细菌分离沙门氏菌细菌分离圆形、微凸、边缘整齐、直径在圆形、微凸、边缘整齐、直径在12 mm的小菌落，菌落无色透明、的小菌落，菌落无色透明、淡黄色透明或外周透明中心黑色淡黄色透明或外周透明中心黑色蓝绿色或蓝色菌落，产硫化氢菌蓝绿色或蓝色菌落，产硫化氢菌株菌落中心带黑色株菌落中心带黑色实验室分离实验室分离链球菌在血液
7、琼脂中生长为无色透明、链球菌在血液琼脂中生长为无色透明、圆形、光滑、隆起的露滴状小菌落圆形、光滑、隆起的露滴状小菌落巴氏杆菌在血琼脂平板生长为巴氏杆菌在血琼脂平板生长为淡灰白色，闪光的露珠状小菌淡灰白色，闪光的露珠状小菌落落形态学检查形态学检查 染色标本的检查染色标本的检查 通过对标本的涂片及染色观察细菌的形态、大小、排列、染色特性，通过对标本的涂片及染色观察细菌的形态、大小、排列、染色特性，一及荚膜、鞭毛、芽孢、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步识别或一及荚膜、鞭毛、芽孢、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步识别或诊断。诊断。 1.涂片：从肉汤或平板上挑取菌液或菌落，涂布在滴有生理盐水的玻片涂片：
8、从肉汤或平板上挑取菌液或菌落，涂布在滴有生理盐水的玻片上，涂片厚薄适当。上，涂片厚薄适当。 2.固定：涂片干燥后，在火焰上迅速通过固定：涂片干燥后，在火焰上迅速通过3次，加热固定。次，加热固定。 3.染色：滴加染液覆盖菌膜。染色：滴加染液覆盖菌膜。 4.脱色：乙醇是最常用的脱色剂，脱色：乙醇是最常用的脱色剂，70%乙醇和无机酸脱色能力强。乙醇和无机酸脱色能力强。 5.复染：复染可使脱色的细菌重新着色。复染：复染可使脱色的细菌重新着色。 常用的染色方法常用的染色方法 革兰氏染色法：最常用的一种染色方法革兰氏染色法：最常用的一种染色方法 （1）染色步骤）染色步骤 结晶紫初染：结晶紫染色结晶紫初染：
9、结晶紫染色1.5min，水洗，甩干，水洗，甩干 碘液媒染：碘液染色碘液媒染：碘液染色2min，水洗，甩干，水洗，甩干 酒精脱色：酒精脱色：95%乙醇脱色，乙醇脱色，2030s，脱色到无结晶紫为止，水洗，脱色到无结晶紫为止，水洗，甩干甩干 石碳酸复红复染：石碳酸复红染色石碳酸复红复染：石碳酸复红染色1.5min ，水洗，吸水纸吸干。，水洗，吸水纸吸干。 （2）结果）结果 革兰氏阳性蓝紫色，革兰氏阴性紫红色。革兰氏阳性蓝紫色，革兰氏阴性紫红色。大肠杆菌形态鉴定大肠杆菌形态鉴定沙门氏菌形态鉴定沙门氏菌形态鉴定巴氏杆菌形态鉴定巴氏杆菌形态鉴定链球菌形态鉴定链球菌形态鉴定葡萄球菌形态鉴定葡萄球菌形态鉴定
10、病原菌的生化鉴定病原菌的生化鉴定 糖类发酵试验糖类发酵试验原理：不同细菌含有发酵不同糖类的酶，分解糖能力不同，产生代谢物原理：不同细菌含有发酵不同糖类的酶，分解糖能力不同，产生代谢物不同，看细菌是否分解各类糖，是否产酸产气。不同，看细菌是否分解各类糖，是否产酸产气。 葡萄糖代谢类型鉴别试验葡萄糖代谢类型鉴别试验原理：又称氧化原理：又称氧化/ /发酵试验，观察细菌对葡萄糖分解过程中是利用分子氧发酵试验，观察细菌对葡萄糖分解过程中是利用分子氧（氧化性），还是无氧酵解（发酵型），或不分解葡萄糖（产碱性）（氧化性），还是无氧酵解（发酵型），或不分解葡萄糖（产碱性） 三糖铁试验三糖铁试验原理：三糖铁用于
11、观察细菌对糖的发酵能力，以及是否产生硫化氢，可原理：三糖铁用于观察细菌对糖的发酵能力，以及是否产生硫化氢，可初步鉴定细菌的菌属。初步鉴定细菌的菌属。生化鉴定生化鉴定 细菌对药物的敏感性试验细菌对药物的敏感性试验 抗菌药物敏感性试验（抗菌药物敏感性试验（ASTAST，药敏试验），药敏试验）用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用。用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用。常用最低抑菌浓度（常用最低抑菌浓度（MICMIC）表示，即体外能够抑制细）表示，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。菌生长的最低药物浓度。 方法：方法： 扩散法（纸片法）扩散法（纸片法） 稀释法（琼脂稀释法和液体稀
12、释法）稀释法（琼脂稀释法和液体稀释法）快速药敏试验：快速药敏试验： 由病料直接涂布药敏试验与病原菌分离同时进行由病料直接涂布药敏试验与病原菌分离同时进行（16-24h16-24h），），可可根据药敏结果初步进行治疗。根据药敏结果初步进行治疗。前增菌法药敏试验：前增菌法药敏试验： 挑取组织培养后菌落，放于灭菌肉汤培养液中，涂抹进行药敏实挑取组织培养后菌落，放于灭菌肉汤培养液中，涂抹进行药敏实验验8-12h8-12h后观察结果。后观察结果。 传统法药敏试验：传统法药敏试验： 耗时较长（耗时较长（2-32-3天），对于一般养殖场定期监测病原菌及其敏感性天），对于一般养殖场定期监测病原菌及其敏感性时，
13、可以使用此方法。能较好地分离出病原菌，病原菌经纯培养后，时，可以使用此方法。能较好地分离出病原菌，病原菌经纯培养后，进行药敏试验，得出的数据可以准确反应出病原菌对某一药物的敏进行药敏试验，得出的数据可以准确反应出病原菌对某一药物的敏感性。感性。试验方法试验方法（1 1）样品处理：）样品处理： 用灭菌棉签沾取组织内部，然后打开装有增菌液（营养肉汤）用灭菌棉签沾取组织内部，然后打开装有增菌液（营养肉汤）的管子，使增菌液与棉签充分混匀，盖上盖子，做好标记，放入恒的管子，使增菌液与棉签充分混匀，盖上盖子，做好标记，放入恒温箱中温箱中3737培养培养12-2412-24小时，此肉汤菌液为前增菌液。小时，
14、此肉汤菌液为前增菌液。（2 2）细菌分离培养：）细菌分离培养： 待取出装有沾取病变组织灭菌棉签的试管，观察营养肉汤中的待取出装有沾取病变组织灭菌棉签的试管，观察营养肉汤中的细菌变混浊。若变混浊，用接种环挑取菌液，无菌操作划线接种于细菌变混浊。若变混浊，用接种环挑取菌液，无菌操作划线接种于麦康凯琼脂、麦康凯琼脂、SSSS琼脂，琼脂，3737培养培养12-24h12-24h，观察是否有细菌生长，初，观察是否有细菌生长，初步判定感染病原菌的类型。步判定感染病原菌的类型。操作过程操作过程前增菌药敏试验前增菌药敏试验（3 3）涂板、贴纸片：）涂板、贴纸片： 用灭菌棉签沾取稀释的培养液，在管壁清碰几下，挤
15、掉多余水用灭菌棉签沾取稀释的培养液，在管壁清碰几下，挤掉多余水分，均匀涂抹于营养琼脂平板上，反复几次，每次将平板旋转分，均匀涂抹于营养琼脂平板上，反复几次，每次将平板旋转6060度，度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀，并贴上药敏纸片，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀，并贴上药敏纸片，3737倒置培养倒置培养 8 8 - 18h- 18h，观察结果。，观察结果。操作过程操作过程（4 4） 结果观察、判定标准结果观察、判定标准 抑抑菌菌圈圈：用用游游标标卡卡尺尺从从平平板板背背面面精精确确测测量量各各个个抑抑菌菌圈圈直直径径（精精确确到到0.01mm0.01mm），抑抑菌菌圈圈的的边边缘缘以以肉肉眼眼见
16、见不不到到细细菌菌明明显显生生长长为为限限。原原料料药药判判定定按按抗微生物药物敏感性试验执行标准抗微生物药物敏感性试验执行标准20102010成品药判定标准成品药判定标准 ： 20 mm 20 mm 极敏极敏 15-20 mm 15-20 mm 高敏高敏 10-14 mm 10-14 mm 中敏中敏 10 mm 10 mm 不敏不敏 选药原则：敏感而价格低的药，实际的运用选药原则：敏感而价格低的药，实际的运用过程中应交叉给药，以减少耐药菌株的产生过程中应交叉给药，以减少耐药菌株的产生细菌学实验操作注意事项细菌学实验操作注意事项1 1、无菌观念要加强，双重保护很重要。、无菌观念要加强，双重保护很重要。2 2、发病前期好时机，最好三两混合取。、发病前期好时机，最好三两混合取。3 3、细菌分离常练习，分离手法越熟练。、细菌分离常练习，分离手法越熟练。4 4、染色三不过、染色三不过 涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度。涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度。5 5、药敏实验方法多，选取最佳很重要。、药敏实验方法多，选取最佳很重要。
