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1、实验二实验二 、培养基及胰酶的配制、培养基及胰酶的配制一、实验原理：一、实验原理：（一）细胞培养的气体环境与（一）细胞培养的气体环境与pHpH环境环境 ( ( 二）细胞培养的营养条件二）细胞培养的营养条件 1. 1. 培养用液培养用液 培养液（基）、缓冲液、平衡盐溶液、血清培养液（基）、缓冲液、平衡盐溶液、血清及消化液、及消化液、pHpH调节液和抗生素等。调节液和抗生素等。 血清的主要成分及含量血清的主要成分及含量 培养基的主要种类（基础培养基）培养基的主要种类（基础培养基）(1) MEM (1) MEM (低限量基础培养基，低限量基础培养基，minimum minimum eessentia
2、leessential media):media): (2) (2) DMEM(DulbeccosDMEM(Dulbeccos modified Eagle modified Eagle medium)medium)(3) (3) IMDM(IscovesIMDM(Iscoves modified modified DulbeccosDulbeccos medium)medium)(4) RPMI1640(4) RPMI1640(5) HamF10(5) HamF10、 HamF12HamF12(6) McCoys 5A(6) McCoys 5A 消消 化化 液液 0.1-0.25% 0.1-
3、0.25% 胰酶胰酶 0.02% 0.02% EDTAEDTA pH=8.0 pH=8.0 二、实验目的二、实验目的1. 1. 掌握掌握DMEMDMEM培养基、胰酶的配制培养基、胰酶的配制2. 2. 学习学习针头滤器的使用方法针头滤器的使用方法三、实验步骤三、实验步骤 ( (一）一） DMEMDMEM培养基的配制培养基的配制1. 1. 三袋三袋DMEMDMEM粉末用双蒸水溶解（先加入粉末用双蒸水溶解（先加入2/3DDW2/3DDW，再用，再用DDWDDW冲洗冲洗袋子）、磁力搅拌器搅拌半小时以上。袋子）、磁力搅拌器搅拌半小时以上。2. 2. 加入加入1.2g/1.2g/袋袋 NaHCO3NaHC
4、O3定容定容3000 3000 mLmL、搅拌、搅拌3030分钟。分钟。每人在超净台内用大滤器过滤、分装、写好种类、名字。（留每人在超净台内用大滤器过滤、分装、写好种类、名字。（留取少许做污染测试放取少许做污染测试放CO2CO2培养箱培养箱7272小时）小时）3. 3. 每每8 8个人为一组，每人过滤个人为一组，每人过滤90 90 mLmL，其余的过滤到，其余的过滤到100 100 mLmL试剂试剂瓶中，每瓶瓶中，每瓶90mL90mL培养基备用。培养基备用。 使用前在超净台内加入使用前在超净台内加入5656灭活好的灭活好的FCS 10 FCS 10 mLmL，使，使血清的终浓度为血清的终浓度为
5、10%10%，44保存待用。保存待用。（二）胰酶的配制（二）胰酶的配制1. 取实验一中准备好的取实验一中准备好的DHanks DHanks 液液 200 200 mLmL （8 8人一组）人一组）2. 2. 称取称取0. 5g0. 5g胰酶（胰酶（0.25%0.25%）放入研磨器中并加入少量）放入研磨器中并加入少量D D HanksHanks液成为糊状，研磨液成为糊状，研磨200200次，再加入次，再加入D HanksD Hanks液终体积为液终体积为200ml200ml，合并胰酶，加，合并胰酶，加0.02%EDTA0.02%EDTA助消化，磁力搅拌使之完全溶助消化，磁力搅拌使之完全溶解。（解
6、。（8 8人一组，分别研磨，再合并）人一组，分别研磨，再合并）3. 3. 用用NaHCO3 NaHCO3 调调pHpH至至8.08.0。4. 4. 小滤器（实验一中已湿热灭菌过的）过滤除菌至小瓶内小滤器（实验一中已湿热灭菌过的）过滤除菌至小瓶内, ,( (不能装的过满不能装的过满, ,防止冷冻后瓶爆裂防止冷冻后瓶爆裂) )、检查滤器、贴好标签、检查滤器、贴好标签、- -2020保存。每人过滤保存。每人过滤20 20 mLmL 。（注意：（注意：1.1.拧紧滤器拧紧滤器2.2.注射器吸液体注射器吸液体3.3.注射器插好滤器注射器插好滤器4.4.对着对着烧杯慢推压针芯看是否漏烧杯慢推压针芯看是否漏5.5.如不漏对小瓶过滤。如不漏对小瓶过滤。6.6.滤器放在小滤器放在小瓶瓶口上，取下针头再吸液体，反复多次，滤完。瓶瓶口上，取下针头再吸液体，反复多次，滤完。7.7.检查滤器检查滤器滤膜是否完好。）滤膜是否完好。）四、思考题四、思考题1.1.细胞培养中为什么添加血清？细胞培养中为什么添加血清？2.2.使用血清需注意哪些方面？使用血清需注意哪些方面？3.3.消化液胰酶的浓度是多少？消化液胰酶的浓度是多少？4.4.使用小滤器过滤要注意哪些？使用小滤器过滤要注意哪些？
