高效液相色谱讲座

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1、高效液相色谱讲座高效液相色谱讲座河南省食品药品检验所河南省食品药品检验所 2009-05-312009-05-311液相色谱理论发展简况液相色谱理论发展简况 n色谱法最早是由俄国植物学家色谱法最早是由俄国植物学家茨维特茨维特（Tswett）在）在1906年研究植物叶子的组成年研究植物叶子的组成时所用的一种方法。他用碳酸钙作吸附剂，时所用的一种方法。他用碳酸钙作吸附剂，分离植物干燥叶子的石油醚萃取物。分离植物干燥叶子的石油醚萃取物。n他把干燥的碳酸钙粉末装到一根长的玻璃管他把干燥的碳酸钙粉末装到一根长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒到管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒到管中的碳酸钙上

2、，萃取液的色素就吸附在管内中的碳酸钙上，萃取液的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内的碳酸钙上就形成吸附的色素，于是在管内的碳酸钙上就形成了三种颜色的了三种颜色的6个色带。个色带。2液相色谱理论发展简况液相色谱理论发展简况n当时，茨维特把这种色带叫做当时，茨维特把这种色带叫做色谱色谱(Chromatography)，色谱法因之得，色谱法因之得名。名。n在这一方法中，把玻璃管叫做在这一方法中，把玻璃管叫做“色谱柱色谱柱”，碳酸钙叫做，碳酸钙叫做“固定相固定相”，纯净的石，纯净的石油醚叫做油醚叫做“流动相流动相”。这就是

3、最早的液。这就是最早的液固色谱法。固色谱法。n后来在此基础上又发展出纸色谱法、薄后来在此基础上又发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 3石油醚石油醚碳酸钙颗粒碳酸钙颗粒色素色素玻璃柱玻璃柱俄国植物学家茨维特（俄国植物学家茨维特（Tswett）在）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。因之得名。4色谱法的分离原理是：n溶于流动相溶于流动相(mobile phase)中的中的各组各组分分，经过固定相时，由于与固定相，经过固定相时，由于与固定相(sta

4、tionary phase)发生作用发生作用（吸附、（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）分配、离子吸引、排阻、亲和）的大的大小、强弱不同小、强弱不同，那么在固定相中滞留，那么在固定相中滞留的时间就不同，故从固定相中的时间就不同，故从固定相中流出的流出的先后也就不同先后也就不同。n这种方法被称为色层法、层析法。这种方法被称为色层法、层析法。 5色谱分离过程色谱分离过程Temporalcourse流流动动相相6液相色谱理论发展简况液相色谱理论发展简况n液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典

5、液相色谱法，此方法柱效相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。低、时间长（常有几个小时）。n高效液相色谱法高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是是在经典液相色谱法的基础上，于在经典液相色谱法的基础上，于60年代年代后期引入了后期引入了气相色谱气相色谱理论而迅速发展起理论而迅速发展起来的。来的。 7液相色谱理论发展简况液相色谱理论发展简况n它与经典液相色谱法的区别是它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而填料颗粒小而均匀均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动

6、相，故又称高压液相色谱需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。n又因分析速度快而称为高速液相色谱法又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。也称现代液相色谱。 8HPLC系统系统 n一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。器、数据记录及处理装置等组成。其中其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气有

7、的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代控制器等，现代HPLC仪还有微机控制仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装仪还备有自动馏分收集装置。置。 910高效液相色谱仪高效液相色谱仪( HPLC)n目前常见的目前常见的HPLC仪生产厂家仪生产厂家国外国外有有Waters公司、公司、Agilent公司公司（原（原HP公司）、岛津公司等，公司）、岛津公司等，n国内有国内有大连依利特公司、上海分大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂

8、等。析仪器厂、北京分析仪器厂等。 11美国美国AgilentAgilent美国美国WatersWaters12美国戴安美国戴安日本岛津日本岛津美国美国VARIANVARIAN日本岛津日本岛津13 Waters高效液相色谱仪高效液相色谱仪14 日本岛津高效液相色谱仪日本岛津高效液相色谱仪15开机前的准备工作开机前的准备工作n1、将试验要求的、将试验要求的流动相流动相配制好。配制好。n2、流动相要、流动相要过滤脱气过滤脱气。n3、装好装好试验要求的试验要求的色谱柱色谱柱。1617流动相流动相:溶剂的沸点和粘度溶剂的沸点和粘度n低沸点的溶剂通常其粘度低，但它在泵低沸点的溶剂通常其粘度低，但它在泵中易

9、形成气泡而影响泵的精度，还因易中易形成气泡而影响泵的精度，还因易蒸发而改变混合流动相的组成。蒸发而改变混合流动相的组成。n高沸点的溶剂通常会因其粘度而降低柱高沸点的溶剂通常会因其粘度而降低柱效。对于有缔合倾向的溶剂（特别是水效。对于有缔合倾向的溶剂（特别是水和乙腈，水和甲醇），它们的粘度随组和乙腈，水和甲醇），它们的粘度随组成的变化是不规律的。例如：水：乙腈成的变化是不规律的。例如：水：乙腈（35：65），水：甲醇（），水：甲醇（50：50）时，）时，其粘度最大。其粘度最大。18开机前的准备工作开机前的准备工作n流动相要流动相要过滤过滤:以除去其中的微粒物质。以除去其中的微粒物质。n滤滤 膜：

10、膜：(0.45m)n脂溶性滤膜（有机滤膜），脂溶性滤膜（有机滤膜），n水溶性滤膜，水溶性滤膜，n通用型滤膜通用型滤膜(聚四氟乙烯能适用于所有溶剂聚四氟乙烯能适用于所有溶剂)。nHPLC级溶剂（色谱纯）使用时不必再过滤了，级溶剂（色谱纯）使用时不必再过滤了，因生产工艺中已用因生产工艺中已用0.2m的的过滤装置过滤过了。过滤装置过滤过了。19开机前的准备工作开机前的准备工作n脱脱 气：气：为了防止在泵中、流路中、及检测器中为了防止在泵中、流路中、及检测器中产生气泡，而影响泵不稳定性（使流速不稳）产生气泡，而影响泵不稳定性（使流速不稳）和增加检测器的噪声，和增加检测器的噪声，流动相必须脱气流动相必须

11、脱气。n混合流动相比纯溶剂更能溶解空气，极易饱和混合流动相比纯溶剂更能溶解空气，极易饱和形成气泡，有水的流动相特别明显。形成气泡，有水的流动相特别明显。n脱气方法：脱气方法：氦气脱气，氦气脱气，真空脱气（用真空真空脱气（用真空过滤流动相脱气，在线脱气机脱气），过滤流动相脱气，在线脱气机脱气）， 超超声脱气，声脱气， 加热脱气。加热脱气。n以不使流动相中混合物浓度发生变化为原则。以不使流动相中混合物浓度发生变化为原则。20贮液瓶贮液瓶n贮液瓶是用来装流动相的容器，里面还含有贮液瓶是用来装流动相的容器，里面还含有一个一个不锈钢烧结过滤器不锈钢烧结过滤器。n泵进液管路泵进液管路一般用聚四氟乙烯管。一

12、般用聚四氟乙烯管。不锈钢烧不锈钢烧结过滤器套在结过滤器套在进液管路上，有两个功能：一进液管路上，有两个功能：一是防止微粒物质进入泵，二是作为进液管路是防止微粒物质进入泵，二是作为进液管路的重物，所以常被称为的重物，所以常被称为“沉子沉子”。n贮液瓶如被污染了可能会阻塞过滤片，影响贮液瓶如被污染了可能会阻塞过滤片，影响泵的性能泵的性能(使流速不稳使流速不稳)，出杂峰或产生噪声。，出杂峰或产生噪声。21反相色谱法反相色谱法n一般用一般用非极性固定相非极性固定相（如（如C18、C8）；流动）；流动相为相为极性强的水极性强的水或缓冲液，常加入甲醇、乙或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等

13、与水互溶的腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。有机溶剂以调节保留时间。n适用于分离非极性和极性较弱的化合物。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。nRPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个计，它占整个HPLC应用的应用的80%左右。左右。 22反相色谱柱反相色谱柱n以硅胶为基质的液相色谱填料多为反相以硅胶为基质的液相色谱填料多为反相柱，正相柱不太多。柱，正相柱不太多。n常用硅胶健合常用硅胶健合C18、C8等填料柱。等填料柱。n对硅胶做碱性脱活的反相柱（在高温对硅胶做碱性脱活的反相柱（在高温下硅烷化封闭硅羟基），（这类填料对下

14、硅烷化封闭硅羟基），（这类填料对碱性物质如对胺有很小的吸附性）。碱性物质如对胺有很小的吸附性）。n高稳定性反相柱（这种柱可以经过酸高稳定性反相柱（这种柱可以经过酸和碱的作用）。和碱的作用）。23硅胶为基质的一些缺点：硅胶为基质的一些缺点：n在碱性介质中（在碱性介质中（pH8）不稳定。）不稳定。n在孔隙中大分子扩散困难，降低柱效。在孔隙中大分子扩散困难，降低柱效。n硅胶表面上的剩余硅羟基有离子交换硅胶表面上的剩余硅羟基有离子交换作用。作用。24反相色谱法中应注意：反相色谱法中应注意：n尽量不使用乙酸盐缓冲溶液，因为它和尽量不使用乙酸盐缓冲溶液，因为它和带阳离子的溶质会形成非极性络合物。带阳离子的

15、溶质会形成非极性络合物。n不使用卤化物，以免腐蚀液相色谱仪。不使用卤化物，以免腐蚀液相色谱仪。n对水的质量要求很高。一般应用新鲜的对水的质量要求很高。一般应用新鲜的高纯水。乐百氏也可以用。高纯水。乐百氏也可以用。n每次试验用水都应更换新鲜的水，因水每次试验用水都应更换新鲜的水，因水易变质，不能长时间不更换。易变质，不能长时间不更换。25正相色谱法正相色谱法n采用采用极性固定相极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈如聚乙二醇、氨基与腈基键合相基键合相)；流动相为相对；流动相为相对非极性的疏水非极性的疏水性溶剂性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三

16、氯甲加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。烷等以调节组分的保留时间。n常用于分离中等极性和极性较强的化合常用于分离中等极性和极性较强的化合物物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 常用的有硅胶柱。常用的有硅胶柱。 26反相反相HPLC极性极性:固定相固定相流动相流动相固定相固定相-极性强极性强流动相流动相(己烷己烷,庚烷庚烷)-极性弱极性弱极性小物质先出峰极性小物质先出峰正相色谱正相色谱20%反相色谱反相色谱80%正相色谱正相色谱20%反相色谱反相色谱80%主流固定相与流动相固定相与流动相27物理性质物理性质硅胶纯度硅胶纯度色谱柱尺寸色

17、谱柱尺寸颗粒形状颗粒形状粒径粒径表面积表面积孔径孔径键合类型键合类型碳覆盖率碳覆盖率封端封端化学性质化学性质固定相固定相- -填充材料填充材料28物理性质物理性质硅胶纯度硅胶纯度色谱柱尺寸色谱柱尺寸颗粒形状颗粒形状粒径粒径表面积表面积孔径孔径填料硅胶的纯度填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度与残留金属离子浓度固定相固定相- -填充材料填充材料29键合类型键合类型碳覆盖率碳覆盖率封端封端化学性质化学性质固定相固定相- -填充材料填充材料3031固定相固定相- -填充材料填充材料32色谱柱常用的色谱柱常用的pH值值:n随着柱填料的快速发展，反相色谱法的随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大

18、，现已应用于某些无应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的流动相的pH值。但需要注意的是，值。但需要注意的是，C18和和C8使用的使用的pH值通常为值通常为2.57.5（28），太高的），太高的pH值会使硅值会使硅胶溶解，太低的胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在落。有报告新商品柱可在pH 1.510范范围操作。围操作。33色谱柱色谱柱34色谱柱色谱柱35开机顺序：开机顺序：n1、打开主机，检测器，色谱工作站等电、打开

19、主机，检测器，色谱工作站等电源开关。源开关。n2、将配制好的流动相放入流动相通道内，、将配制好的流动相放入流动相通道内，旋开排液（或灌液）旋钮，将流动相管旋开排液（或灌液）旋钮，将流动相管路中存放的老溶剂替换掉。路中存放的老溶剂替换掉。n3、关上排液（或灌液）旋钮，逐渐将流、关上排液（或灌液）旋钮，逐渐将流速升高。平衡至少速升高。平衡至少30分钟后准备进样。分钟后准备进样。36替换掉管路中存放的老溶剂替换掉管路中存放的老溶剂37替换掉管路中存放的老溶剂替换掉管路中存放的老溶剂38进样前准备进样前准备样品过滤样品过滤一次性注射器针式（头）过滤器样品瓶39 六通阀六通阀/定量环进样器定量环进样器4

20、0仪器：手动进样器仪器：手动进样器- -六通阀六通阀/ /定量环定量环41手动进样器工作原理手动进样器工作原理 装填状态装填状态样品注入样品注入42手动进样器手动进样器4344n液相色谱中，用液相色谱中，用定量定量环进样时环进样时，注射器的，注射器的抽取量抽取量不得少于不得少于环容环容积的积的5倍倍 。 45仪器：检测器仪器：检测器46UV/Vis双灯，全波长检测检测器流路仪器：检测器仪器：检测器- -紫外紫外47反射镜反射镜1反射镜反射镜2氘灯氘灯光源透镜光源透镜滤光片（钬玻璃滤光片（钬玻璃/遮光）遮光）入射狭缝入射狭缝光栅光栅分光器分光器参比光电二极管参比光电二极管数模转换板数模转换板样品

21、光电二极管样品光电二极管数模转换板数模转换板流通池流通池紫外检测器工作原理紫外检测器工作原理Agilent 1100 可变波长紫外检测器可变波长紫外检测器(G1314A)4849荧光检测器荧光检测器50蒸发光检测器蒸发光检测器51质谱检测器质谱检测器525354基本概念和术语基本概念和术语 n色谱图色谱图(chromatogram)样品流经色谱柱和检测样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。n基线基线(base line)经流动相冲洗，柱与流动相达到经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测

22、出一段时间的流出曲线。一般应平平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。行于时间轴。n噪音噪音(noise)基线信号的波动。通常因电源接触不基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。谱柱被污染所致。n漂移漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移 55基本概

23、念和术语基本概念和术语n色谱峰色谱峰(peak)组分流经检测器时响应的组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰前延峰(leading peak)和拖尾峰和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。前者少见。n峰底峰底基线上峰的起点至终点的距离。基线上峰的起点至终点的距离。n峰高峰高(peak height，h)峰的最高点至峰底峰的最高点至峰底的距离。的距离。 56基本概念和术

24、语基本概念和术语n峰宽（峰宽（peak width，W)峰两侧拐点处所作峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。两条切线与基线的两个交点间的距离。W4n半峰宽（半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)峰高一半处的峰宽。峰高一半处的峰宽。Wh/22.355n峰面积峰面积(peak area，A)峰与峰底所包围的峰与峰底所包围的面积。面积。n保留时间保留时间(retention time，tR)从进样开从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。 57基本概念和术语基本概念和术语n理论塔板数理论塔板数(theore

25、tical plate number，N)用于定量表示色谱柱用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。的分离效率（简称柱效）。n分离度分离度(resolution，R)相邻两峰的相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R1.5称为完全分离。称为完全分离。n中国药典中国药典规定规定R应大于应大于1.5。58理论塔板数理论塔板数(N)59分离度分离度(R)(R)60基本概念和术语基本概念和术语n拖尾因子拖尾因子(tailing factor，T)用以用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因衡量色谱峰的

26、对称性。也称为对称因子子(symmetry factor)或不对称因子或不对称因子(asymmetry factor)。n中国药典中国药典规定规定T应为应为0.951.05。nT0.95为前延峰，为前延峰，T1.05为拖尾峰。为拖尾峰。6162定性或定量定性或定量n通过与对照品保留时间的一致性来进行通过与对照品保留时间的一致性来进行定性定性。n定量常用定量常用:na:a:外标法外标法nb:b:内内标法法63液相色谱分离定量常用的基本公式液相色谱分离定量常用的基本公式na:a:外标法外标法 n含量（含量（ C X C X ）= C R = C R AX / AX /ARARn nCXCX为供试品

27、浓度为供试品浓度 AXAX为供试品峰面积为供试品峰面积 nCRCR为对照品浓度为对照品浓度 AR为对照品峰面积为对照品峰面积64液相色谱分离定量常用的基本公式液相色谱分离定量常用的基本公式nb:b:内内标法法 n校正因子（校正因子（f f）= = AS CR /CSAS CR /CS AR n 含量（含量（ C X C X ）= f = f AX CS /AS AX CS /AS n AX AX为供试品峰面积 CXCX为供试品浓度 n AR为对照品峰面积 CR为对照品浓度n ASAS为内标峰面积 CSCS为内标浓度65对仪器的一般要求对仪器的一般要求 :n除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外

28、吸收检测器。 n正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。66报告书书写内容：报告书书写内容：n检品名称：检品名称：*片片 批批 号：号：200702016n检验项目：中国药典检验项目：中国药典2005年版二部附录年版二部附录 Dn标准规定：含标准规定：含*应为标示量的应为标示量的90.0%110.0%n仪器编号：仪器编号：YQ .H . 测定日期：测定日期： 室温：室温： n色谱柱编号：色

29、谱柱规格：色谱柱编号：色谱柱规格：4.6mm250 mmn色色 谱谱 柱：固定相柱：固定相C18 柱柱 温：温：25 n检检 测测 器：紫外检测器器：紫外检测器 检测波长：检测波长： 260nm n流流 动动 相：水相：水乙腈（乙腈（60 40）n流速：流速：1 ml/min 进进 样样 量：量：20 l67报告书书写内容：报告书书写内容：n理论板数规定值：按理论板数规定值：按*峰计算不低峰计算不低于于1000 测定值：测定值：n分离度规定值：大于分离度规定值：大于1.5 测定值：测定值：n对照品名称：对照品名称：* 对对照品批号：照品批号：123-200701n对照品来源：中国药品生物制品检

30、定所对照品来源：中国药品生物制品检定所68报告书书写内容：报告书书写内容：n试验方法试验方法n试验计算试验计算n试验结果试验结果n试验结论试验结论69HPLC日常维护日常维护总结总结70一、定期检查溶剂过滤器一、定期检查溶剂过滤器n查看过滤器是否变色临时取下过滤器，查看过滤器是否变色临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常检查柱前压力是否正常n清洁溶剂过滤器清洁溶剂过滤器n将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下。将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下。先用水冲洗残留之溶剂先用水冲洗残留之溶剂，然后将过滤器，然后将过滤器放在装有浓硝酸放在装有浓硝酸 （35）的烧杯里浸一）的烧杯里浸一小时小时，不要使用超声波

31、清洗。，不要使用超声波清洗。n用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器。建议不用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器。建议不使用超声波清洗机清洗。使用超声波清洗机清洗。n将过滤器重新装好。将过滤器重新装好。71一、定期检查溶剂过滤器一、定期检查溶剂过滤器n建议定期清洗溶剂过滤器及溶剂建议定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶，每三个月至少清洗一次瓶，每三个月至少清洗一次。n注意：不要使用没有安装溶剂过注意：不要使用没有安装溶剂过滤器的系统可能会严重堵塞系滤器的系统可能会严重堵塞系统统.72日常维护日常维护n流动相应经过流动相应经过0.45um或更小孔径的滤器或更小孔径的滤器过滤，如果使用滤膜，注意有机膜与水过滤，如果使用滤膜，注意

32、有机膜与水膜的区别膜的区别(聚四氟乙烯能适用于所有溶剂聚四氟乙烯能适用于所有溶剂)n注意不同检测器流通池耐压问题，尽量注意不同检测器流通池耐压问题，尽量避免使用避免使用pH9.5的流动相，以防腐蚀流的流动相，以防腐蚀流通池石英窗，避免使用可能析晶的流动通池石英窗，避免使用可能析晶的流动相，防止流通池堵塞相，防止流通池堵塞73使用使用PEEK（polyetheretherketone）管）管路和接头需要注意什么问题？路和接头需要注意什么问题？如果如果经常需要改变流路经常需要改变流路或更或更换不同品牌的色谱柱换不同品牌的色谱柱，使用使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。材料制成的管路和接头会

33、非常方便。PEEK管路容易连接；管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。 使用此类材料的管路需要注意的是：使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，材料的明显迹象，但但PEEK遇到上述溶剂会变脆。遇到上述溶剂会变脆。74使用使用PEEK管路和接头需要注意什么问管路和接头需要注意什

34、么问题？题？n另一个需要考虑的因素是压力限。不锈钢管可另一个需要考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受耐受6000psi的压力，但的压力，但PEEK管只能耐受近管只能耐受近4000psi（但多数（但多数HPLC应用系统压力不会超应用系统压力不会超过过3000psi）。）。n使用使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而接头压力限低于不锈钢管，因而压力高时，可能会使接头在管路上滑动而产生压力高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。

35、死体积或漏液。75如何预防液相泵的故障如何预防液相泵的故障:n 要保持泵的良好操作性能要保持泵的良好操作性能,必须维护系必须维护系统的清洁统的清洁,保证溶剂和试剂的质量保证溶剂和试剂的质量,对流动对流动相进行过滤和脱气相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障下面列出预防泵故障的几项措施的几项措施: 1) 用高质量试剂和用高质量试剂和HPLC级溶剂；级溶剂； 2）过滤流动相和溶剂；）过滤流动相和溶剂； 3）脱气；）脱气； 4）每天开始使用时放空排气，工作）每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；结束后从泵中洗去缓冲液； 5）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中； 76

36、高效液相色谱中高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法常遇见的问题及处理方法 77基线噪音大可能由那些原因引起基线噪音大可能由那些原因引起n 可能原因是：可能原因是：泵压不稳泵压不稳，流动池有，流动池有气泡气泡，流动池被污染，对紫外检测器可将流动流动池被污染，对紫外检测器可将流动池移走即可确认。池移走即可确认。 色谱柱色谱柱污染污染，系统管路，系统管路污染污染。 灯能量灯能量不足不足，光学系统老化或污染，参，光学系统老化或污染，参数设计不合理。数设计不合理。 外界因素影响，如电源，温度和湿度，外界因素影响，如电源，温度和湿度，震动，等。震动，等。78峰面积重现性不好峰面积重现性不好1. 首先观察压

37、力是否稳定，以及观察峰面积变化首先观察压力是否稳定，以及观察峰面积变化是否有规律。是否有规律。 若压力不稳定，若压力不稳定，请检查造成压力请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。 2. 若压力稳定但峰面积呈无规律变化，若压力稳定但峰面积呈无规律变化，请检查请检查样品是否足够，确认样品的稳定性，必要时重样品是否足够，确认样品的稳定性，必要时重新配制。检查进样阀是否漏液。等。新配制。检查进样阀是否漏液。等。 3. 若压力稳定且若压力稳定且峰面积呈规律变化，峰面积

38、呈规律变化，多数为色多数为色谱柱未平衡好。谱柱未平衡好。79保留时间不稳定保留时间不稳定1. 首先观察保留时间是否有规律的变化，首先观察保留时间是否有规律的变化，并同时观察压力是否稳定，并同时观察压力是否稳定，若压力稳定若压力稳定而保留时间呈有规律变化，而保留时间呈有规律变化，多数是色谱多数是色谱柱未平衡好，特别是含有的流动相，需柱未平衡好，特别是含有的流动相，需较长的时间去平衡。较长的时间去平衡。2. 若压力稳定而保留时间无规律变化，若压力稳定而保留时间无规律变化，请请检查溶剂过滤头及真空腔是否有堵塞。检查溶剂过滤头及真空腔是否有堵塞。再平衡色谱柱足够时间，如仍然不佳，再平衡色谱柱足够时间，

39、如仍然不佳，可更换一色谱柱。可更换一色谱柱。3. 若压力不稳定，若压力不稳定，请检查造成压力不稳定请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。漏，等。80一、保留时间缩短保留时间缩短 1.流速增加流速增加2.样品超载样品超载3.键合相流失键合相流失4.流动相组成变化流动相组成变化5.温度增加温度增加1.检查泵检查泵,重新设定流速重新设定流速2.降低样品量降低样品量3.流流动动相相PH值值保保持持在在37.5检查柱的方向检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀防止流动相蒸发或沉淀5

40、.柱恒温柱恒温81二、保留时间延长保留时间延长 1.流速下降流速下降2.硅硅胶胶柱柱上上活活性性点点变化变化3.键合相流失键合相流失4.流动相组成变化流动相组成变化5.温度降低温度降低1.管管路路泄泄漏漏,更更换换泵泵密密封封圈圈,排排除泵内气泡除泵内气泡2.用用流流动动相相改改性性剂剂,如如加加三三乙乙胺胺,或采用碱至钝化柱或采用碱至钝化柱3.流流动动相相PH值值保保持持在在37.5检查柱的方向检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温柱恒温82三三、 出现肩峰或分叉出现肩峰或分叉 1.样品体积过大样品体积过大2.样品溶剂过强样品溶剂过强3.柱柱塌塌陷陷或或形形成成短

41、短路通道路通道4.柱柱内内烧烧结结不不锈锈钢钢失效失效5.进样器损坏进样器损坏1.用用流流动动相相配配样样,总总的的样样品品体体积积小于第一峰的小于第一峰的15%2.采用较弱的样品溶剂采用较弱的样品溶剂3.更更换换色色谱谱柱柱,采采用用较较弱弱腐腐蚀蚀性性条件条件4.更更换换烧烧结结不不锈锈钢钢,加加在在线线过过滤滤器器,过滤样品过滤样品5.更换进样器转子更换进样器转子83四、鬼峰鬼峰 1.进样阀残余峰进样阀残余峰2.样品中未知物样品中未知物3.柱未平衡柱未平衡4.三三氟氟乙乙酸酸(TFA)氧化氧化(肽谱肽谱)5.水污染水污染(反相反相)1.每每次次用用后后用用强强溶溶剂剂清清洗洗阀阀,改进阀

42、和样品的清洗改进阀和样品的清洗2.处理样品处理样品3.重重新新平平衡衡柱柱,用用流流动动相相作作样样品品溶溶剂剂(尤尤其其是是离离子子对对色谱色谱)4.每天新配每天新配,用抗氧化剂用抗氧化剂5.通通过过变变化化平平衡衡时时间间检检查查水水质量，用质量，用HPLC级的水级的水84五、五、 基线噪声基线噪声 1.气泡气泡(尖锐峰尖锐峰)2.污染污染(随机噪声随机噪声)3.检检测测器器灯灯连连续续噪声噪声4.电电干干扰扰(偶偶然然噪噪声声)5.检检测测器器中中有有气气泡泡1.流流动动相相脱脱气气,加加柱柱后后背压背压2.清清洗洗柱柱,净净化化样样品品,用用HPLC级试剂级试剂3.更换氘灯更换氘灯4.

43、采采用用稳稳压压电电源源,检检查查干干扰扰的的来来源源(如如水水浴等浴等)5.流流动动相相脱脱气气,加加柱柱后后背压背压85六、峰拖尾峰拖尾 1.柱超载柱超载2.峰干扰峰干扰3.硅羟基作用硅羟基作用4.柱柱内内烧烧结结不不锈锈钢钢失效失效5.柱柱塌塌陷陷或或形形成成短短路通道路通道6.死死体体积积或或柱柱外外体体积过大积过大7.柱效下降柱效下降1.降降低低样样品品量量,增增加加柱柱直直径径采采用用较较高高容量的固定相容量的固定相2.清洁样品清洁样品,调整流动相调整流动相3.加加三三乙乙胺胺,用用碱碱致致钝钝化化柱柱增增加加缓缓冲冲液液或或盐盐的的浓浓度度降降低低流流动动相相PH值值,钝钝化样品

44、化样品4.更更换换烧烧结结不不锈锈钢钢,加加在在线线过过滤滤器器,过过滤样品滤样品5.更换色谱柱更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件采用较弱腐蚀性条件6.连连接接点点降降至至最最低低,对对所所有有连连接接点点作作合合适适调调整整,尽尽可可能能采采用用细细内内径径的的连连接管接管7.用用较较低低腐腐蚀蚀条条件件,更更换换柱柱,采采用用保保护护柱柱86七、峰展宽峰展宽 1.进样体积过大进样体积过大2.在在进进样样阀阀中中造造成成峰峰扩展扩展3.数数据据系系统统采采样样速速率率太慢太慢4.检检测测器器时时间间常常数数过过大大1.用用流流动动相相配配样样,总总的的样样品品体体积积小小于于第第一一峰峰的的15%2.进进样样前前后后排排出出气气泡泡以以降低扩散降低扩散3.设设定定速速率率应应是是每每峰峰大大于于10点点4.设设定定时时间间常常数数为为感感兴兴趣第一峰半宽的趣第一峰半宽的10%87谢谢 谢谢 ！88