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1、生物化学实验课件实验一实验一 糖类的性质实验（实验一和二）糖类的性质实验（实验一和二）实验二实验二 氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定-纸层析法纸层析法（7 7）实验三实验三 蛋白质及氨基酸的呈色反应（蛋白质及氨基酸的呈色反应（8 8）实验四实验四 酶的特性（酶的特性（1818）实验五实验五 脂肪碘值的测定脂肪碘值的测定(5)(5)实验六实验六 蛋白质的等电点测定和沉淀反应蛋白质的等电点测定和沉淀反应(9)(9)实验七实验七 米氏常数的测定米氏常数的测定(20)(20)实验八实验八 维生素维生素C C的定量测定的定量测定(23)(23)实验课是提高教学质量的重要环节。通过实验巩实验课是提高教学质
2、量的重要环节。通过实验巩实验课是提高教学质量的重要环节。通过实验巩实验课是提高教学质量的重要环节。通过实验巩固理论知识，训练基本操作，培养独立工作的能力，固理论知识，训练基本操作，培养独立工作的能力，固理论知识，训练基本操作，培养独立工作的能力，固理论知识，训练基本操作，培养独立工作的能力，为了保证实验顺利进行，实验前应注意以下几点：为了保证实验顺利进行，实验前应注意以下几点：为了保证实验顺利进行，实验前应注意以下几点：为了保证实验顺利进行，实验前应注意以下几点：实验室规则及安全、卫生教育实验室规则及安全、卫生教育1 1、每次实验前必须详细预习实验讲义，明确实、每次实验前必须详细预习实验讲义，
3、明确实验原理及操作步骤，并在记录本上拟出操作时的注验原理及操作步骤，并在记录本上拟出操作时的注意事项。意事项。2 2、实验时自觉遵守课堂纪律，严格按操作规程、实验时自觉遵守课堂纪律，严格按操作规程操作，既要独立操作又要与其他同学配合。操作，既要独立操作又要与其他同学配合。3 3、实验时应严格按照实验步骤及试剂用量进行、实验时应严格按照实验步骤及试剂用量进行操作，不能任意变更。不熟悉的仪器和设备，应先操作，不能任意变更。不熟悉的仪器和设备，应先请老师讲解后使用，切勿随意乱动。请老师讲解后使用，切勿随意乱动。4 4、实验进行时，必须随时把观察得到的现象和实验数、实验进行时，必须随时把观察得到的现象
4、和实验数、实验进行时，必须随时把观察得到的现象和实验数、实验进行时，必须随时把观察得到的现象和实验数据，如实地记录在记录本上，不得记录在其他纸上，要养成据，如实地记录在记录本上，不得记录在其他纸上，要养成据，如实地记录在记录本上，不得记录在其他纸上，要养成据，如实地记录在记录本上，不得记录在其他纸上，要养成作原始记录的良好习惯。作原始记录的良好习惯。作原始记录的良好习惯。作原始记录的良好习惯。 5 5、实验时如有问题发生，应首先用自己学过的知识，、实验时如有问题发生，应首先用自己学过的知识，、实验时如有问题发生，应首先用自己学过的知识，、实验时如有问题发生，应首先用自己学过的知识，独立思考加以
5、解决，培养独立分析问题和解决问题的能力，独立思考加以解决，培养独立分析问题和解决问题的能力，独立思考加以解决，培养独立分析问题和解决问题的能力，独立思考加以解决，培养独立分析问题和解决问题的能力，如自己不能解决，可与指导老师共同讨论研究，提出解决问如自己不能解决，可与指导老师共同讨论研究，提出解决问如自己不能解决，可与指导老师共同讨论研究，提出解决问如自己不能解决，可与指导老师共同讨论研究，提出解决问题的办法。题的办法。题的办法。题的办法。 6 6、精心爱护各种仪器。实验所需的一般仪器按规定借、精心爱护各种仪器。实验所需的一般仪器按规定借、精心爱护各种仪器。实验所需的一般仪器按规定借、精心爱护
6、各种仪器。实验所需的一般仪器按规定借领，归还。完成实验后应将仪器洗净倒置于实验柜中并排列领，归还。完成实验后应将仪器洗净倒置于实验柜中并排列领，归还。完成实验后应将仪器洗净倒置于实验柜中并排列领，归还。完成实验后应将仪器洗净倒置于实验柜中并排列整齐。如有损坏或遗失，需要说明原因，经指导教师签名后整齐。如有损坏或遗失，需要说明原因，经指导教师签名后整齐。如有损坏或遗失，需要说明原因，经指导教师签名后整齐。如有损坏或遗失，需要说明原因，经指导教师签名后方可补领，并按规定赔偿。方可补领，并按规定赔偿。方可补领，并按规定赔偿。方可补领，并按规定赔偿。7、精密贵重仪器每次使用后应登记姓名并记录仪器使用情
7、况。要随时保持仪器的清洁。如发生故障，应立即停止使用并报告指导教师。8、验中所用得玻璃仪器及其它器皿，应洗涤干净，桌面、地面要保持清洁有序，实验完毕后，所用仪器设备应恢复原状。9、必须遵守实验室规则：、必须遵守实验室规则：（1）室内不得高声谈笑，保持安静的实验环境。）室内不得高声谈笑，保持安静的实验环境。（2）爱护仪器，不得浪费药品，节省水电，遵守学生守则）爱护仪器，不得浪费药品，节省水电，遵守学生守则及实验室安全、卫生等制度。及实验室安全、卫生等制度。（3）公用仪器及试剂瓶用完后应及不要移动原有的位置。）公用仪器及试剂瓶用完后应及不要移动原有的位置。注意瓶塞切勿盖错，以免污染试剂，用毕后立即
8、放回原处。对注意瓶塞切勿盖错，以免污染试剂，用毕后立即放回原处。对于有害药品，应按实验室规定取用。于有害药品，应按实验室规定取用。（4）滤纸、火柴棒、碎玻璃等应投入废品袋，切勿丢入水）滤纸、火柴棒、碎玻璃等应投入废品袋，切勿丢入水池，以保证下水道畅通。池，以保证下水道畅通。（5）如用仪器有损坏，立即向指导老师报告，再行登记。）如用仪器有损坏，立即向指导老师报告，再行登记。（6）保持实验室的整齐清洁，个人所带与实验无关的东西，）保持实验室的整齐清洁，个人所带与实验无关的东西，如书包等要放在实验室指定地方，不得乱放在实验桌上。如书包等要放在实验室指定地方，不得乱放在实验桌上。（7）由学生轮流值日，
9、值日生要负责当天实验室的卫生、）由学生轮流值日，值日生要负责当天实验室的卫生、安全和服务性的工作，特别注意打扫水槽中废弃物。安全和服务性的工作，特别注意打扫水槽中废弃物。（8）最后一组实验人员，离开实验室时，检查水、电、门、）最后一组实验人员，离开实验室时，检查水、电、门、窗是否关闭，以保证实验室安全。窗是否关闭，以保证实验室安全。（9）如有突发事件（起火、试剂腐蚀伤人）发生，不要惊）如有突发事件（起火、试剂腐蚀伤人）发生，不要惊慌失措，应妥善处置（使用灭火机、关闭电源等）。慌失措，应妥善处置（使用灭火机、关闭电源等）。实验一实验一 糖类的性质实验糖类的性质实验糖类的重要鉴别方法是糖类的重要鉴
10、别方法是 反应和反应和反应。糖类、苷类及其他含糖物质与反应。糖类、苷类及其他含糖物质与 萘酚和萘酚和浓硫酸呈紫红色的环的反应称为浓硫酸呈紫红色的环的反应称为 反应，该反应反应，该反应可用于糖类和非糖物质的鉴别。酮糖糖加入间苯二酚和可用于糖类和非糖物质的鉴别。酮糖糖加入间苯二酚和盐酸能产生红色的反应称为盐酸能产生红色的反应称为反应，该反应可用于酮糖和醛糖的鉴别。如己酮糖加入间苯反应，该反应可用于酮糖和醛糖的鉴别。如己酮糖加入间苯二酚和浓盐酸，加热后迅速产生红色，而同样条件下己醛糖二酚和浓盐酸，加热后迅速产生红色，而同样条件下己醛糖的反应速度要慢得多。的反应速度要慢得多。非还原性糖在酸存在下，加热
11、水解后产生还原性非还原性糖在酸存在下，加热水解后产生还原性的单糖。淀粉的水解是逐步发生的，先水解成紫糊的单糖。淀粉的水解是逐步发生的，先水解成紫糊精，再水解成红糊精、无色糊精、麦芽糖，最终水精，再水解成红糊精、无色糊精、麦芽糖，最终水解成葡萄糖。用碘液可以检查这种水解过程。完全解成葡萄糖。用碘液可以检查这种水解过程。完全水解后，可用试剂加以证实。水解后，可用试剂加以证实。多糖类遇浓硫酸被水解成单糖，单糖被浓硫酸脱多糖类遇浓硫酸被水解成单糖，单糖被浓硫酸脱水闭环，形成糠醛类化合物，在浓硫酸存在下与水闭环，形成糠醛类化合物，在浓硫酸存在下与 萘萘酚发生酚醛缩合反应，生成紫红色缩合物。酚发生酚醛缩合
12、反应，生成紫红色缩合物。一、实验目的：一、实验目的：1、了解糖类某些颜色反应的原理；、了解糖类某些颜色反应的原理；2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法；、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法；3、学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及、学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及 其原理。其原理。二、实验原理二、实验原理(一一)颜色反应颜色反应1. -1. -萘酚反应萘酚反应萘酚反应萘酚反应糖在浓无机酸糖在浓无机酸（硫酸或盐酸）（硫酸或盐酸）（硫酸或盐酸）（硫酸或盐酸）作用下，脱水生作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与成糠醛及糠醛衍生物，后者能与-萘酚生成紫红色萘酚生成紫红色物质。物质。注意：因糠
13、醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，注意：因糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，注意：因糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，注意：因糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，不是糖类的特异反应。不是糖类的特异反应。不是糖类的特异反应。不是糖类的特异反应。OCHO-CH2OH2. 间苯二酚反应间苯二酚反应在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮糖的特异反应。因为醛糖在同此反应是酮糖的特异反应。因为醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微
14、弱的阳性反应。或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。(二二) 还原作用还原作用许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、银等金属离或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、银等金属离或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、银等金属离或酮基，因此在碱性溶液中能将铜、铁、银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸
15、及其他产物。糖类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定量测定。量测定。量测定。量测定。本实验所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂。它们都是本实验所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂。它们都是CuCu2 2的碱的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色（颗粒大）或黄色（颗粒小）性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色（颗粒大）或黄色（颗粒小）的的CuCu2OO沉淀。沉淀。本尼迪克特试剂是改良的斐林试剂。（见P100,101脚注）三、器材及试剂三、器材及
16、试剂1 1、器材：、器材：、器材：、器材：试管、试管架、滴管、水浴锅（或电炉）试管、试管架、滴管、水浴锅（或电炉）2 2、试剂：、试剂：、试剂：、试剂： 1%1%葡萄糖溶液，葡萄糖溶液，1%1%果糖溶液，果糖溶液，1%1%蔗糖溶液，蔗糖溶液，1%1%淀粉，淀粉，1%1%麦芽糖溶液，麦芽糖溶液，0.1%0.1%糠醛溶液，糠醛溶液，浓硫酸，浓硫酸，莫氏试剂，莫氏试剂，塞氏试剂，塞氏试剂，斐林试剂，斐林试剂，本尼迪克特试剂本尼迪克特试剂四、实验步骤四、实验步骤 1 1、-萘酚反应萘酚反应萘酚反应萘酚反应1%1%葡萄溶液葡萄溶液葡萄溶液葡萄溶液1%1%果糖溶液果糖溶液果糖溶液果糖溶液各加各加1ml1m
17、l 各加各加各加各加2 2滴滴滴滴 各加各加各加各加1ml1ml 1%1%蔗糖溶液蔗糖溶液蔗糖溶液蔗糖溶液莫氏试剂莫氏试剂莫氏试剂莫氏试剂 浓硫酸浓硫酸浓硫酸浓硫酸1%1%淀粉溶液淀粉溶液淀粉溶液淀粉溶液 0.1%0.1%糠醛溶液糠醛溶液糠醛溶液糠醛溶液 5支支试试管管混混匀匀观观察察记记录录各各管管颜颜色色Molisch反应（反应（ -萘酚反应萘酚反应）浓浓H2SO4界面：显色界面：显色- 鉴定：所有的糖类均可显色鉴定：所有的糖类均可显色 2. 间苯二酚反应间苯二酚反应 1%1%葡萄糖溶液葡萄糖溶液葡萄糖溶液葡萄糖溶液 各加各加各加各加0.5ml0.5ml 各加各加各加各加5ml5ml 1%
18、1%果糖溶液果糖溶液果糖溶液果糖溶液 赛氏试剂赛氏试剂赛氏试剂赛氏试剂 1%1%蔗糖溶液蔗糖溶液蔗糖溶液蔗糖溶液 3支支试试管管混混 均均同同 时时置置 沸沸水水 浴浴中中观观 察察记记 录录各各 管管颜色颜色3、糖与斐林试剂的反应、糖与斐林试剂的反应1 1）检验试剂：）检验试剂：）检验试剂：）检验试剂： 1ml斐斐林试剂林试剂或或1ml本本尼尼迪迪克克特试剂特试剂4ml蒸蒸馏馏水水 1支支试试管管加加热热煮煮沸沸观观察察现现象象2）实验过程2ml2ml斐林试剂斐林试剂 1%1%葡萄糖溶液葡萄糖溶液各加各加 1ml1ml 1%1%果糖溶液果糖溶液 或或1%1%蔗糖溶液蔗糖溶液1%1%麦芽糖溶液
19、麦芽糖溶液 2ml2ml本尼迪克特本尼迪克特1%1%淀粉溶液淀粉溶液试剂试剂 5支支试试管管观观察察记记录录各各管管颜颜色色置置沸沸水水浴浴中中加加热热取取出出冷冷却却五、实验数据记录（五、实验数据记录（五、实验数据记录（五、实验数据记录（P99,10299,102）六、实验思考题：六、实验思考题：六、实验思考题：六、实验思考题： 1.1.可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在？可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在？2.-2.-萘酚反应的原理是什么？萘酚反应的原理是什么？ 3.3.斐林试剂、本尼迪克特试剂检验糖的斐林试剂、本尼迪克特试剂检验糖的原理是什么？原理是什么？七、预习：七、预习：七、预习：七、预习：
20、P P109109实验二实验二实验二实验二实验二实验二 脂肪碘值的测定脂肪碘值的测定实验时取样多少决定于油脂样品的碘值。可参考表实验时取样多少决定于油脂样品的碘值。可参考表1与表与表2： 一、实验目的一、实验目的 1 1、学习和掌握测定脂肪碘值的原理和方法。、学习和掌握测定脂肪碘值的原理和方法。 2 2、了解和学习、了解和学习空白对照实验空白对照实验的原理和方法的原理和方法教材第教材第6、7页页二、实验原理二、实验原理碘值（价）是指碘值（价）是指100g100g脂肪在一定条件下吸收碘的脂肪在一定条件下吸收碘的克数。碘值是鉴别脂肪的一个重要常数，可用以判断克数。碘值是鉴别脂肪的一个重要常数，可用
21、以判断脂肪所含脂肪酸的不饱和程度。脂肪所含脂肪酸的不饱和程度。脂肪中常含有不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸具有脂肪中常含有不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸具有一个或多个双键，能与卤素起加成作用而吸收卤素。一个或多个双键，能与卤素起加成作用而吸收卤素。常用碘与脂肪中不饱和脂肪酸的双键起加成作用。脂肪的不饱和程度越高，所含的不饱和脂肪酸越多，与其双键起加成作用的碘量就越多，碘值就越高。故可用碘值表示脂肪的不饱和度。 I I I I2 2 2 2+CH= = = =CHCHICHI 本实验用溴化碘(Hanus试剂)代替碘。用一定量(必须过量)溴化碘和待测的脂肪作用后，用硫代硫酸钠滴定的方法测定溴化碘的剩余量，然
22、后计算出待测脂肪吸收的碘量，求得脂肪的碘值。 加成作用：加成作用：IBr+CH=CHCHICHBr 剩余溴化碘中碘的释放：剩余溴化碘中碘的释放： IBr + KI KBr + I2再用硫代硫酸钠滴定释放出来的碘：再用硫代硫酸钠滴定释放出来的碘： I2 +2Na2S2O3 2Na2S4O6+2NaI三、器材及试剂三、器材及试剂1 1、器材、器材： 碘瓶，量筒，滴定管，吸量管，滴管，分析天平碘瓶，量筒，滴定管，吸量管，滴管，分析天平碘瓶，量筒，滴定管，吸量管，滴管，分析天平碘瓶，量筒，滴定管，吸量管，滴管，分析天平2 2、试剂：、试剂： 花生油，花生油，花生油，花生油，HanusHanusHanu
23、sHanus试剂试剂试剂试剂, , , , 四氯化碳，四氯化碳，四氯化碳，四氯化碳，10%10%10%10%碘化钾溶液碘化钾溶液碘化钾溶液碘化钾溶液 0.1084mol/L 0.1084mol/L 0.1084mol/L 0.1084mol/L 硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠溶液，硫代硫酸钠溶液， 1%1%1%1%淀粉溶液淀粉溶液淀粉溶液淀粉溶液四、实验步骤四、实验步骤0.3-0.4g0.3-0.4g油两份油两份 洁净碘瓶洁净碘瓶 加入加入10ml10ml四氯化碳四氯化碳 轻轻轻轻振动振动 加入加入HanusHanus试剂试剂25ml25ml塞好瓶塞，并在塞子与瓶口塞好瓶塞，并在塞
24、子与瓶口间加入数滴间加入数滴KIKI溶液溶液 混匀混匀 置暗处置暗处3030分钟分钟(25(25度度) ) 打开打开瓶塞，将瓶塞，将KIKI流入瓶内流入瓶内 加入加入KI 10mlKI 10ml和蒸馏水和蒸馏水50ml,50ml,将瓶塞将瓶塞和瓶颈上的液体冲入瓶内和瓶颈上的液体冲入瓶内 混匀混匀 用用0.1ml/L0.1ml/L的的NaNa2 2S S2 2O O3 3滴定滴定至淡黄色至淡黄色 加入加入1%1%淀粉溶液约淀粉溶液约1ml1ml继续滴定继续滴定 至接近滴定终点至接近滴定终点( (蓝色极淡蓝色极淡) ) 加塞用力振荡加塞用力振荡 再滴至滴定终点（水层与非水层再滴至滴定终点（水层与非
25、水层全部都无色）全部都无色） 另外再做一份空白实验另外再做一份空白实验。( (除不加样品外，其它操作同除不加样品外，其它操作同样品实验。样品实验。) )附附 注注（1 1）碘瓶必须洁净、干燥，否则油中含有水分，引起反）碘瓶必须洁净、干燥，否则油中含有水分，引起反应不完全。应不完全。（2 2）加碘试剂后，如发现碘瓶中颜色变浅褐色时，表明）加碘试剂后，如发现碘瓶中颜色变浅褐色时，表明试剂不够，必须再添加试剂不够，必须再添加10101515mLmL试剂。试剂。 （3 3）如加入碘试剂后，液体变浊，这表明油脂在）如加入碘试剂后，液体变浊，这表明油脂在CClCCl4 4中中溶解不完全，可再加些溶解不完全
26、，可再加些CClCCl4 4。（。（4 4）将近滴定终点时，用力）将近滴定终点时，用力振荡是本滴定成败的关键之一，否则容易滴加过头或不足。振荡是本滴定成败的关键之一，否则容易滴加过头或不足。如震荡不够，如震荡不够，CClCCl4 4展会出现紫或红色，此时应用力振荡，使展会出现紫或红色，此时应用力振荡，使碘进入水层。碘进入水层。（5 5）淀粉溶液不宜加得过早，否则滴定值偏高。）淀粉溶液不宜加得过早，否则滴定值偏高。五、实验结果记录五、实验结果记录 1 1 1 1、原始数据记录、原始数据记录、原始数据记录、原始数据记录 1 1 1 1）花生油的质量）花生油的质量）花生油的质量）花生油的质量 W W
27、 W W值值值值 2 2 2 2）NaNaNaNa2 2 2 2S S S S2 2 2 2O O O O3 3 3 3摩尔浓度摩尔浓度摩尔浓度摩尔浓度 C C C C值值值值2 2）滴定结果记录：）滴定结果记录： A A A A为滴定空白所消耗的为滴定空白所消耗的为滴定空白所消耗的为滴定空白所消耗的NaNaNaNa2 2 2 2S S S S2 2 2 2O O O O3 3 3 3溶液溶液溶液溶液mLmLmLmL数；数；数；数；B B B B为滴定样品所消耗的为滴定样品所消耗的为滴定样品所消耗的为滴定样品所消耗的NaNaNaNa2 2 2 2S S S S2 2 2 2O O O O3 3
28、 3 3溶液溶液溶液溶液mLmLmLmL数；数；数；数；c c c c为为为为NaNaNaNa2 2 2 2S S S S2 2 2 2O O O O3 3 3 3溶液的摩尔浓度。溶液的摩尔浓度。溶液的摩尔浓度。溶液的摩尔浓度。最后求出平均碘值。最后求出平均碘值。最后求出平均碘值。最后求出平均碘值。六、思考题：六、思考题： 1 1 1 1、何谓碘值？具有什么意义？、何谓碘值？具有什么意义？、何谓碘值？具有什么意义？、何谓碘值？具有什么意义？ 2 2 2 2、何谓空白溶液和空白实验？空白实验有何意义？、何谓空白溶液和空白实验？空白实验有何意义？、何谓空白溶液和空白实验？空白实验有何意义？、何谓空
29、白溶液和空白实验？空白实验有何意义？七、预习：七、预习：P122 实验三 氨基酸的分离鉴定-纸层析法一、层析技术简介层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。 层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似，而用一般化学方法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。二、层析的分类1、按分离相状态分类：根据层析过程中的固定相和流动相进行分类，大致可以分以下几类：（
30、1）气相层析是以气体为流动相的层析方法，称之为气相层析。根据固定相的性质不同又可以分为气-固层析(GSC)和气-液层析(GLC)。前者是指载体表面含有许多吸附基团的固体吸附介质，后者是指载体表面涂有一层薄薄液体分子制成的介质。（2）液相层析是以液体为流动相的层析方法，称之为液相层析。同理，根据固定相的性质不同又可以把液相层析分为液-固层析(LSC)和液-液层析(LLC)。液相层析的固定相性质与气相层析相近。（3）超临界层析是以流体为流动相的层析方式，称为超临界层析(SFC)。它是利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点的条件下进行分离的，这种分离方法更具专一性。2、按层析的分离机理分类（1）排阻层
31、析利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为排阻层析。（2）离子交换层析利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法，称之为离子交换层析。（3）吸附层析利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析。 （4 4）分配层析）分配层析被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附和解
32、吸附的作用，在移动的过程中物质在两相之间进行分配。利用被分离物质在两相中分配系数的差异而进行分离的一种方法，称之为分配层析。 （5）亲和层析在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。（6）金属螯合层析利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法，称之为金属螯合层析。（7）疏水层析利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法，称之为
33、疏水层析。（8）反向层析利用固定相载体上偶联的疏水性较强的配基，在一定非极性的溶剂中能够与溶剂中的疏水分子发生作用，以非极性配基为固定相，极性溶剂为流动相来分离不同极性的物质的方法，称之为反相层析。（9）聚焦层析利用固定相载体上偶联的载体两性电解质分子，在层析过程中所形成的pH梯度，并与流动相中不同等电点的分子发生聚焦反应进行分离的方法，称之为聚焦层析。（10）灌注层析利用刚性较强的层析介质颗粒中具有的不同大小贯穿孔与流动相中溶质分子分子量的差异进行分离的方法，称之为灌注层析。实验三实验三 氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定-纸层析法纸层析法氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定-纸层析法纸层析法一、
34、实验目的一、实验目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法二、实验原理二、实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。法。( ( ( (其原理参见其原理参见其原理参见其原理参见P P P P33333333) ) ) )层析溶剂由有机溶剂层析溶剂由有机溶剂( ( ( (或称有机相，是流动的、或称有机相，是流动的、或称有机相，是流动的、或称有机相，是流动的、被水饱和的，构成流动相被水饱和的，构成流动相被水饱和的，构成流动相被水饱和的，构成流动相) ) ) )和水和水( ( ( (通常是被结合在滤通常是被结合在滤通常是被结合在滤通常是被结
35、合在滤纸上，构成固定相纸上，构成固定相纸上，构成固定相纸上，构成固定相) ) ) )组成。组成。(P(P(P(P34343434纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间纤维之间纤维之间纤维之间纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之纸层析原理：在纸上，水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相，由于纤维素与水的氢键作用，使水不易间形成固定相，由于纤维素与水的氢键作用，使水不易扩散，并能与跟水混合的溶剂扩散，并能与跟水混合的溶剂( (有机相有机相) )形成类似不相混形成类似不相混
36、合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域，这时又重离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域，这时又重新进行分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相新进行分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。
37、不同，因而可以彼此分开。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的： 原点到层析点中心的距离原点到层析点中心的距离 R Rf f 原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数，Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量、展层方式、层析温度和pH等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、器材及试剂三、器材及试剂1、器材：器材：器材：器材：层析缸（或标本缸），毛细管，喷雾层析缸（或标本缸），毛细管，喷雾器，电吹风，培养皿，层析滤纸器，电吹风，培养皿，层析滤纸(质地必须均一、平整及厚薄均匀，要有一定的强度。新华1号或3号滤纸(或Wh
38、atman 1号或3号滤纸)2、试剂：试剂：试剂：试剂：0.5%0.5%的赖氨酸，的赖氨酸，0.5%0.5%的脯氨酸，的脯氨酸，0.5%0.5%的缬氨酸，的缬氨酸，0.5%0.5%的苯丙氨酸，的苯丙氨酸，0.5%0.5%的混合的混合氨基氨基. .酸，显色剂，扩展剂酸，显色剂，扩展剂四、实验步骤四、实验步骤1 1取扩展剂约取扩展剂约5ml5ml置于小烧杯中做平衡溶剂，置于小烧杯中做平衡溶剂，然后将小烧杯置于密闭的层析缸中（或标本缸）。然后将小烧杯置于密闭的层析缸中（或标本缸）。2 2取层析滤纸（长取层析滤纸（长22cm22cm，宽，宽14cm14cm）一张。）一张。在纸的一端距边缘在纸的一端距边
39、缘2-3cm2-3cm处用铅笔划一条直线，在处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔此直线上每间隔2cm2cm作一个记号作一个记号(“”(“”型而不是型而不是型而不是型而不是“ “.”.”型型型型) )，共作，共作5 5个记号作为点样点；另外，沿展层个记号作为点样点；另外，沿展层方向在滤纸两边距边缘约方向在滤纸两边距边缘约0.5-1cm0.5-1cm处对称地划两条处对称地划两条直线，分别将其四等分，各取其三个等分点作为缝直线，分别将其四等分，各取其三个等分点作为缝线点。线点。3 3、点样、点样、点样、点样 用毛细管将各种氨基酸样品分别点在这用毛细管将各种氨基酸样品分别点在这6 6个点样点个点样点位
40、置上位置上(注意速度要快，否则易扩散开注意速度要快，否则易扩散开)，干后再点一次。每，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过点在纸上扩散的直径最大不超过3mm3mm。4 4扩展扩展扩展扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触，将盛用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触，将盛有约有约20ml20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需要低于点样纸的液面需要低于点样纸1cm1cm）。待溶剂上升）。待溶剂上升15-15-20cm20cm时取出滤纸，用铅笔描
41、出溶剂前沿界线，自然时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或者用吹风机吹干。干燥或者用吹风机吹干。5 5显色显色 用喷雾器均匀喷上用喷雾器均匀喷上0.1%0.1%茚三酮正丁醇茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤溶液，然后置烘箱中烘烤5 5分钟（分钟（100100）或用热风）或用热风吹干即可以显出个层析斑点。吹干即可以显出个层析斑点。6 6计算各种氨基酸的计算各种氨基酸的RfRf值值五、实验结果记录五、实验结果记录六、思考题：六、思考题：1 1何谓纸层析法？何谓纸层析法？2 2何谓何谓R Rf f值？影响值？影响R Rf f值的主要因素是什么？值的主要因素是什么？3 3怎样制备扩展剂？怎样制
42、备扩展剂？预习：实验四预习：实验四 蛋白质及氨基酸的呈色反应。蛋白质及氨基酸的呈色反应。 P P125125实实 验验 四四 蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白质及氨基酸的呈色反应一、实验目的一、实验目的1 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。2 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3 3学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、实验原理二、实验原理（一）双缩脲反应双缩脲反应双缩脲反应: :尿素加热至尿素加热至180180左右，生成双缩脲并左右，生成双缩脲并放
43、出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与CuCu2+2+结合生成结合生成紫红色化合物。紫红色化合物。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，能发蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，能发生双缩脲反应。这可用于蛋白质的定性或定量测定。生双缩脲反应。这可用于蛋白质的定性或定量测定。注意注意: :双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所特有，许多含有一个肽键和一个氨基的物质也能质所特有，许多含有一个肽键和一个氨基的物质也能发生此反应发生此反应 如如 CS-NHCS-NH2 2，-CH-CH2 2-NH-NH2 2，O=C C=O O
44、=C C=O 等。等。 NHNH2 2 NHNH2 2NHNH3 3也干扰此反应，因为也干扰此反应，因为NHNH3 3与与CuCu2+2+可生成暗蓝色可生成暗蓝色的络离子的络离子( Cu(NH( Cu(NH3 3) )4 42+ 2+ ，四氨合铜，四氨合铜) )。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。（二）茚三酮反应除脯氨酸，羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应
45、(尿素、马尿酸和肽键上的亚氨基不呈现此反应。)因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定是蛋白质或氨基酸。在定性定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳，氨和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮。第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。(此反应的适宜pH为5-7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同的pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。)（三）黄色反应 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，
46、遇硝含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。一步形成深橙色的硝醌酸钠。 ( (多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，注多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，注意苯丙氨酸不易硝化，需加入少量的浓硫酸才有黄色反应，该反意苯丙氨酸不易硝化，需加入少量的浓硫酸才有黄色反应，该反应非常灵敏。应非常灵敏。) )（四）考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。(它染色灵
47、敏度高，比氨基黑高3倍，反应速度快，约在2分钟达到平衡，在室温1小时内稳定，常用来定量测定蛋白质含量)三、器材及试剂三、器材及试剂1 1 1 1、器材：、器材：、器材：、器材：电炉、试管、试管架、吸管、吸管架等电炉、试管、试管架、吸管、吸管架等2 2 2 2、试剂：、试剂：、试剂：、试剂：尿素尿素, 1%CuSO, 1%CuSO4 4溶液，溶液， 10%NaOH10%NaOH溶液溶液2%2%卵清蛋白溶液，卵清蛋白溶液，0.5%0.5%甘氨酸溶液，甘氨酸溶液，0.1%0.1%茚三茚三酮水溶液，酮水溶液，0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液，茚三酮乙醇溶液，0.5%0.5%苯酚溶液，苯酚溶液，浓硝酸，浓
48、硝酸，0.3%0.3%色氨酸色氨酸0.3%0.3%酪氨酸溶液，考马斯亮蓝酪氨酸溶液，考马斯亮蓝染液。染液。四、实验步骤四、实验步骤双缩脲反应取少量尿素结晶于干燥试管中取少量尿素结晶于干燥试管中 微火加热熔微火加热熔化化 硬化时停止加热硬化时停止加热 冷后，加冷后，加10%NaOH10%NaOH溶液溶液约约1ml 1ml 振荡混匀振荡混匀 加一滴加一滴1%CuSO1%CuSO4 4溶液溶液 再振荡再振荡 观察记录观察记录另取一只试管另取一只试管 加卵清蛋白溶液约加卵清蛋白溶液约1ml 1ml 和和10%NaOH10%NaOH溶液约溶液约2ml 2ml 摇匀摇匀 加加1%CuSO1%CuSO4 4
49、溶液溶液2 2滴滴 随加随摇随加随摇 观察记录观察记录 茚三酮反应(1)(1)取两支试管取两支试管 分别加入蛋白质溶液和甘氨分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液各酸溶液各1ml 1ml 再各加再各加0.1%0.1%茚三酮水溶液茚三酮水溶液0.5ml 0.5ml 混匀混匀 沸水浴中加热沸水浴中加热1 12 2分钟分钟 观察观察(2)(2)在一小块滤纸上滴一滴在一小块滤纸上滴一滴0.5%0.5%甘氨酸溶液甘氨酸溶液 风干风干 在原处滴一滴在原处滴一滴0.1%0.1%茚三酮乙醇溶液茚三酮乙醇溶液 微火旁烘干显色微火旁烘干显色 观察观察 黄色反应向向6 6支试管中分别按下表加入试剂，观察各试管支试管中分别按
50、下表加入试剂，观察各试管出现的现象，待各管出现黄色后，与室温下逐滴加入出现的现象，待各管出现黄色后，与室温下逐滴加入 10%NaOH10%NaOH溶液至碱性，观察颜色变化。溶液至碱性，观察颜色变化。 考马斯亮蓝反应 取取2 2支试管，按下表操作：支试管，按下表操作：五、实验结果记录五、实验结果记录 见见P P131-132131-132表表六、思考题：六、思考题：通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸通过本实验你掌握了几种鉴定蛋白质和氨基酸的方法？它们的原理是什么？的方法？它们的原理是什么？ 七、预习：七、预习：P133P133实验五实验五 蛋白质等电点测定和蛋白质等电点测定和沉淀反应沉淀反
51、应实验五实验五 蛋白质的等电点测定和沉淀反应蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、实验目的一、实验目的1 1、了解蛋白质的两性解离性质；、了解蛋白质的两性解离性质；2 2、学习测定蛋白质等电点的方法；、学习测定蛋白质等电点的方法；3 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识；、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识；4 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义；、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义；5 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。、了解蛋白质变性与沉淀的关系。二、实验原理二、实验原理二、实验原理二、实验原理( (一一) )蛋白质的等电点的测定蛋白质的等电点的测定蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在
52、下列平衡蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡( (见见P P133133图图) )。 COOHCOOHCOOHCOOH P P P P ( ( ( (蛋白质分子蛋白质分子蛋白质分子蛋白质分子) ) ) ) NH NH NH NH2 2 2 2 COO- COO- COOH COO- COO- COOH COO- COO- COOH COO- COO- COOH P P P P P P P P P P P P NH NH NH NH2 2 2 2 NH NH NH NH3 3 3 3+ NH+ NH+ NH+ NH3 3 3 3+ + + + 阴离子阴离子阴离子阴离子 兼性离子兼性离子
53、兼性离子兼性离子 阳离子阳离子阳离子阳离子 pHpHpHpHpIpIpIpI pH= pH= pH= pH=pIpIpIpI pH pH pH pHpIpIpIpI电场中：电场中：电场中：电场中： 移向阳极移向阳极移向阳极移向阳极 不移动不移动不移动不移动 移向阴极移向阴极移向阴极移向阴极+ H+ H+ OH-+ OH-蛋白质的等电点(pI) ：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液酸碱度的影响，当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动 ，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点(pI)。在等电点时，蛋
54、白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低(或沉淀量最多)时的溶液pH值。本实验借观察不同pH缓冲液中溶解度以测定酪蛋白的等电点。( (二二) )蛋白质的沉淀及变性蛋白质的沉淀及变性 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。沉淀。蛋白质的沉淀反应可以分为两类：蛋白质的沉淀反应可以分为两类：(1)(1)可逆的沉淀反应可逆的沉
55、淀反应( (不变性，如盐析作用或低不变性，如盐析作用或低温作用下用乙醇或丙酮短时间作用温作用下用乙醇或丙酮短时间作用) )(2)(2)不可逆的沉淀反应不可逆的沉淀反应( (变性，如加热沉淀与凝变性，如加热沉淀与凝固、与重金属离子或某些有机酸反应等固、与重金属离子或某些有机酸反应等) )( (注意：蛋白质变性后，由于维持溶液稳定的条注意：蛋白质变性后，由于维持溶液稳定的条件仍然存在件仍然存在( (如电荷如电荷) )，并不析出。因此变性蛋白质，并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性已变性) )三、器材及试剂三、器材及试
56、剂1 1、器材：水浴锅、器材：水浴锅 温度计温度计 容量瓶容量瓶 锥形瓶锥形瓶 吸管吸管 试管试管 吸管架吸管架 试管架试管架2 2、试剂：、试剂： 0.4%0.4%酪蛋白醋酸钠溶液：酪蛋白醋酸钠溶液：1.0mol/L1.0mol/L醋酸溶醋酸溶液液, 0.1mol/L, 0.1mol/L醋酸溶液，醋酸溶液，0.01mol/L0.01mol/L醋酸溶液，蛋白质溶醋酸溶液，蛋白质溶液，液，pH4.7HAc-NaAcpH4.7HAc-NaAc的缓冲溶液，的缓冲溶液，3%3%硝酸银溶液，硝酸银溶液，5%5%三三氯乙酸溶液，乙醇，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵结晶粉末，氯乙酸溶液，乙醇，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵
57、结晶粉末，0.1mol/L0.1mol/L盐酸溶液，盐酸溶液，0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠溶液，氢氧化钠溶液，0.05mol/L0.05mol/L碳碳酸钠溶液，甲基红溶液，酸钠溶液，甲基红溶液，2%2%氯化钡溶液氯化钡溶液四、实验步骤四、实验步骤( (一一) ) 蛋白质的等电点的测定蛋白质的等电点的测定1 1、取同样规格的试管、取同样规格的试管4 4支，按下表顺序分别精确支，按下表顺序分别精确的加入各试剂，然后混匀。的加入各试剂，然后混匀。( (注意：在测定等电点实注意：在测定等电点实验中，要求各种试剂的浓度和加入量相当准确验中，要求各种试剂的浓度和加入量相当准确) )2 2、向以
58、上各试管加酪蛋白的、向以上各试管加酪蛋白的NaAcNaAc溶液溶液 1mL(1mL(加一管，加一管，摇匀一管摇匀一管) )。此时。此时1 1，2 2，3 3，4 4管的管的pHpH依次为依次为5.95.9，5.35.3，4.74.7，3.53.5。观察其混浊度。静置。观察其混浊度。静置1010分钟后，再观察其混分钟后，再观察其混浊度浊度( (最混浊的一管的最混浊的一管的pHpH即为酪蛋白的等电点即为酪蛋白的等电点) )。( (二二) )蛋白质的沉淀及变性蛋白质的沉淀及变性1 1、蛋白质的盐析：无机盐、蛋白质的盐析：无机盐( (硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等) )的的浓溶液能析
59、出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。( (如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出酸铵溶液中才能析出) )蛋白质溶液蛋白质溶液5mL5mL于试管中于试管中 加加5mL5mL饱和硫酸铵饱和硫酸铵 混均静混均静置数分钟置数分钟倒出少量沉淀倒出少量沉淀 加少量水加少量水 观察是否溶解观察是否溶解( (？) ) 2 2、重金属离子沉淀蛋白质、重金属离子沉淀蛋白质( (重金属离子与蛋白质重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物结合成不溶于水的复合物) )取蛋
60、白质溶液取蛋白质溶液 2mL 2mL 于试管中于试管中 加加3%3%硝酸银溶液硝酸银溶液1-21-2滴滴 振荡振荡 放置片刻放置片刻 倾去上清液倾去上清液 向沉淀中加入少量水向沉淀中加入少量水 观察是否溶解观察是否溶解( (？) )3、某些有机酸沉淀蛋白质(PhpI)蛋白质溶液蛋白质溶液2mL2mL于试管中于试管中 加加5%5%三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液1mL 1mL 振荡振荡 放置片刻放置片刻 观察现象观察现象 倾去上清倾去上清液液 向沉淀中加入少量水向沉淀中加入少量水 观察是否溶解观察是否溶解( (？) )4、有机溶剂沉淀蛋白质(蛋白质脱去水化层，降低介电常数)蛋白质溶液蛋白质溶液2mL 2
61、mL 乙醇乙醇2mL 2mL 振荡振荡 观察沉淀？观察沉淀？5、乙醇引起的变性与沉淀 取取3 3支试管，编号。依下表顺序加入试剂：支试管，编号。依下表顺序加入试剂：五、实验结果记录：见五、实验结果记录：见P P140-142140-142六、思考题：何谓蛋白质的等电点和沉淀反六、思考题：何谓蛋白质的等电点和沉淀反应？有何实用意义？应？有何实用意义？七、预习：七、预习： 实验六实验六 酶的特性酶的特性(P(P169169) )实验六实验六 酶的特性酶的特性一、实验目的一、实验目的加深对酶的性质的认识加深对酶的性质的认识二、实验原理二、实验原理（一）温度对酶活力的影响：（一）温度对酶活力的影响：酶
62、的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶的反应速度最高。的反应速度最高。( (大多数动物酶的最适温度大多数动物酶的最适温度37-37-4040，植物酶的最适温度为，植物酶的最适温度为50-6050-60。) )高温可以使酶失活，低温能降低或抑制酶的活性，高温可以使酶失活，低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。但不能使酶失活。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到干燥制剂，虽加热到100100，其活性并无明显改变，其活性并无明显改变，但在但在100100的溶液中却很快地完全失去活性。的溶
63、液中却很快地完全失去活性。淀粉被唾液淀粉酶水解的产物有糊精和麦芽糖。淀粉被唾液淀粉酶水解的产物有糊精和麦芽糖。淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色、不呈色。麦芽糖遇碘也不色、紫色、暗褐色或红色、不呈色。麦芽糖遇碘也不呈色。因此，在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解呈色。因此，在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。（二）（二）（二）（二）pHpHpHpH对酶活性的影响：对酶活性的影响：对酶活性的影响：对酶活性的影响：酶的活力受环境酶的活力受环
64、境pHpH的影响极为的影响极为显著。不同酶的最适显著。不同酶的最适pHpH值不同。值不同。本实验观察本实验观察pHpH对唾液淀粉酶活对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适性的影响，唾液淀粉酶的最适pHpH约为约为6.86.8。( ( ( (三三三三) ) ) )唾液淀粉酶的活化和抑制：唾液淀粉酶的活化和抑制：唾液淀粉酶的活化和抑制：唾液淀粉酶的活化和抑制：酶的活性受活化剂或抑制酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为唾液淀粉剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为唾液淀粉酶的抑制剂。酶的抑制剂。( ( ( (四四四四) ) ) )酶的专一性：酶的专一性：酶的
65、专一性：酶的专一性：酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。( (淀粉和蔗糖无还原性。唾液淀粉酶水解淀粉最终生成有还原性淀粉和蔗糖无还原性。唾液淀粉酶水解淀粉最终生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解生成还的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解生成还原性的葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。用本尼迪克特试剂原性的葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。用本尼迪克特试剂检查糖的还原性。检查糖的还原性。) )三、器材及试剂1 1
66、 1 1、器材：、器材：、器材：、器材：试管及试管架试管及试管架 恒温水浴锅恒温水浴锅 吸管吸管 滴管滴管 锥形瓶锥形瓶 电炉电炉 石棉网石棉网 烧杯烧杯 冰块冰块 塑料盆塑料盆2 2 2 2试剂：试剂：试剂：试剂：0.2%0.2%淀粉的淀粉的0.3%0.3%氯化钠溶液氯化钠溶液( (新鲜配制新鲜配制) )；0.5%0.5%淀粉的淀粉的0.3%NaCl0.3%NaCl溶液溶液( (新鲜配制新鲜配制) )；1%1%淀粉的淀粉的0.3%0.3%氯化钠溶液氯化钠溶液( (新鲜配制新鲜配制) )；稀释；稀释200200倍的唾液倍的唾液( (新鲜配制新鲜配制) )；KI-IKI-I2 2溶液溶液( (用
67、前用前稀释稀释1010倍倍) )；0.2mol/LNa0.2mol/LNa2 2HPOHPO4 4溶液；溶液；0.1mol/L0.1mol/L柠檬酸溶液；柠檬酸溶液；四种四种pHpH试纸试纸(pH=5(pH=5、pH=5.8pH=5.8、pH=6.8pH=6.8、pH=8)pH=8)；0.1%0.1%的淀粉溶的淀粉溶液；液；1% 1% NaClNaCl溶液；溶液；1%CuSO1%CuSO4 4溶液；溶液；1%Na1%Na2 2SOSO4 4溶液；溶液；2%2%蔗糖溶蔗糖溶液；蔗糖酶溶液液；蔗糖酶溶液四、实验步骤四、实验步骤（一）温度对酶活力的影响（一）温度对酶活力的影响 取取3 3支试管，编号
68、，按下表加入试剂：支试管，编号，按下表加入试剂：摇摇匀匀1,3号管37水浴2号管冰水浴10分钟一半一半加KI-I237水浴 10分钟加KI-I2记录现象现象（二）pH对酶活性的影响1 1、配制缓冲液：取、配制缓冲液：取4 4个个50mL50mL锥形瓶，编号，用吸管按锥形瓶，编号，用吸管按P P171171表添加表添加0.2mol/L Na2HPO40.2mol/L Na2HPO4和和0.1mol/l0.1mol/l柠檬酸溶液以制备柠檬酸溶液以制备pH5.0-8.0pH5.0-8.0的的4 4种缓冲液（种缓冲液（PH5.0PH5.0、PH5.8PH5.8、PH6.8PH6.8、PH8.0PH8.
69、0）2 2、过程、过程 取4支试管编 号pH缓冲液3mL0.5%淀粉2 mL间隔1min加已稀释200倍的唾液2 mL混匀依次于37水浴中保温每隔1分钟用白瓷板检验H6.8的试管淀粉水解程度各管间隔1min加1-2滴KI-I2溶液观察各管颜色变化2分钟显示棕黄色后检验方法:待向第4管加入唾液2min后，每隔1min由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴KI-I2溶液，检验淀粉水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1-2滴KI-I2溶液。( ( ( (三三三三) ) ) )唾液淀粉酶的活化和抑制唾液淀粉酶的活化和抑制唾液淀粉酶的活化和抑制唾液淀粉酶的活化和抑制取取4 4支试管
70、，编号，按下表加入各试剂：支试管，编号，按下表加入各试剂： 解释结果，说明本实验第解释结果，说明本实验第3 3管的意义。管的意义。( (注意：保温时间可根据各人唾液淀粉酶活力调整。注意：保温时间可根据各人唾液淀粉酶活力调整。) )( (四四) )酶的专一性：酶的专一性：1 1、淀粉酶的专一性、淀粉酶的专一性( (见见P P174174表表) ) ( (注意：唾液中除含淀粉酶外还含有少量的麦芽糖酶注意：唾液中除含淀粉酶外还含有少量的麦芽糖酶) ) 2 2、蔗糖酶的专一性、蔗糖酶的专一性( (见见P P175175表，与上表区别在于表，与上表区别在于3737恒温水恒温水浴中保温浴中保温5min)5
71、min)五、实验结果记录：见五、实验结果记录：见P P175-177175-177六、思考题：六、思考题：1 1、什么是酶的最适温度和最适、什么是酶的最适温度和最适 pHpH？2 2、什么是酶的活化剂？、什么是酶的抑制剂？、什么是酶的活化剂？、什么是酶的抑制剂？与变性剂有何区别？与变性剂有何区别？3 3、本实验结果如何证明酶的专一性？、本实验结果如何证明酶的专一性？预习：预习： 实验七实验七 米氏常数的测定米氏常数的测定(P(P181181) )实验七实验七 米氏常数的测定米氏常数的测定一、实验目的一、实验目的1 1 1 1、了解底物浓度对酶促反应速度的影响。、了解底物浓度对酶促反应速度的影响
72、。、了解底物浓度对酶促反应速度的影响。、了解底物浓度对酶促反应速度的影响。2 2 2 2、学习测定米氏常数（、学习测定米氏常数（、学习测定米氏常数（、学习测定米氏常数（K K K Km m m m）的原理和方法。）的原理和方法。）的原理和方法。）的原理和方法。VmaxSKm +S 1 vKm 1 1VmaxSVmaxV=二、实验原理二、实验原理 米氏方程米氏方程: :改为双倒数式改为双倒数式 ： = + 1 vKm 1 1VmaxSVmax=+Km值是酶的一个特征常数，测定Km值是酶学研究中的一个重要方法。双倒数作图法是实验方法测定Km值的最常用的比较方便的方法。实验时选择不同的S，测定相对应
73、的V，求出两者的倒数，以1/V对1/S作图，则得到一斜率为Km m/Vmaxmax的直线。将直线外推与横轴相交，由1/Km=-1/S求出Km。本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法测定Km值。胰蛋白酶是胰液中的一个酶，它催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基，因此可以用甲醛滴定法(原理参见P148)判断自由氨基增加的数量来追踪反应。三、器材及试剂1 1、器材：、器材：锥形瓶锥形瓶 碱式滴定管碱式滴定管 滴定台滴定台 蝴蝶夹蝴蝶夹 吸管吸管 量筒量筒 恒温恒温水浴锅水浴锅2 2、试剂：、试剂：pH8.5p
74、H8.5酪蛋白溶液酪蛋白溶液(10(10、2020、3030、40g/ L)40g/ L)；40g/ L40g/ L胰胰蛋白酶溶液；纯甲醛溶液；酚酞蛋白酶溶液；纯甲醛溶液；酚酞(2.5g/ L(2.5g/ L乙醇乙醇) )；标准；标准NaOHNaOH( (约约0.1mol/L)0.1mol/L)溶液溶液四、实验步骤1 1、6 6个小锥形瓶个小锥形瓶 分别加入分别加入2.5mL2.5mL甲醛溶液和甲醛溶液和1 1滴酚酞滴酚酞 分别滴加分别滴加0.1ml/LNaOH0.1ml/LNaOH溶液溶液 至混合至混合物呈为微粉红色物呈为微粉红色( (所有瓶中颜色须一致所有瓶中颜色须一致) )2 2、另取一
75、大锥形瓶、另取一大锥形瓶 加入加入30mL30mL酪蛋白溶液酪蛋白溶液 3737水浴保温水浴保温10min 10min （同时胰蛋白酶溶液也（同时胰蛋白酶溶液也3737水水浴中保温浴中保温10 min10 min）3 3、精确地取、精确地取5mL5mL酶液酶液 加到酪蛋白溶液中，同时记加到酪蛋白溶液中，同时记时时 充分混合充分混合 随即取随即取5mL5mL反应混合物反应混合物( (作为作为0 0时样时样品品) ) 吹至上述含甲醛的小锥形瓶中吹至上述含甲醛的小锥形瓶中 各加入酚酞各加入酚酞（1 1滴酚酞滴酚酞/ml/ml混合液）混合液） 用用0.1mol/LNaOH0.1mol/LNaOH滴定至
76、呈微弱滴定至呈微弱但持的粉红色但持的粉红色 在接近终点时，再加入指示剂在接近终点时，再加入指示剂( (每每mLNaOHmLNaOH溶液加入溶液加入1 1滴酚酞滴酚酞) ) 继续滴定至终点继续滴定至终点 记下所记下所消耗消耗NaOHNaOH的的mLmL数数4 4、在、在2 2、4 4、6 6、8 8和和10min10min时分别取出时分别取出5mL5mL消化样品，准确消化样品，准确地照上法操作，在每一个样品中滴定终点的颜色应当是一致地照上法操作，在每一个样品中滴定终点的颜色应当是一致的，用增加的滴定度对时间作图，测定初速度。的，用增加的滴定度对时间作图，测定初速度。5 5、用不同浓度的酪蛋白溶液
77、（、用不同浓度的酪蛋白溶液（1010，2020，30g/L 30g/L ，40g/L 40g/L ）测定不同底物浓度时的活力。）测定不同底物浓度时的活力。6 6、用实验测得的结果，以、用实验测得的结果，以1/V1/V对对1/S1/S作图，求作图，求出出V Vmaxmax和和K Km m的数值的数值五、实验结果记录：五、实验结果记录：1 1、原始数据记录：不同浓度样品在不同反应时间的、原始数据记录：不同浓度样品在不同反应时间的NaOHNaOH滴定量滴定量( (mm) )2、数据处理1)1)用增加的滴定度对时间用增加的滴定度对时间( (m-tm-t) )作图，测定初速作图，测定初速度度V V0 0
78、2) 2) 用不同浓度的酪蛋白溶液测定不同底物浓度时的用不同浓度的酪蛋白溶液测定不同底物浓度时的反应初速度。反应初速度。3) 3) 以以1/V1/V对对1/S1/S作图，求出作图，求出V Vmaxmax和和K Km m的数值的数值六、思考题：六、思考题：1 1、如何正确测定酶促反应速度？、如何正确测定酶促反应速度？2 2、由实验所得曲线可以看出底物浓度对酶反应的影响有何特、由实验所得曲线可以看出底物浓度对酶反应的影响有何特殊规律？殊规律？七、预习：七、预习： 实验八实验八 维生素维生素C C的定量测定的定量测定(P(P195195) )实验八实验八 维生素维生素C C的定量测定的定量测定一、实
79、验目的一、实验目的1 1、学习维生素、学习维生素C C定量测定法的原理和方法定量测定法的原理和方法2 2、熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技术、熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技术二、实验原理还原型维生素还原型维生素C(C(抗坏血酸抗坏血酸) )能还原染料能还原染料2,6-2,6-二氯二氯酚靛酚钠盐，本身则被氧化成脱氢维生素酚靛酚钠盐，本身则被氧化成脱氢维生素C C。2,6-2,6-二二氯酚靛酚钠盐的水溶液呈蓝色，在酸性环境中为玫氯酚靛酚钠盐的水溶液呈蓝色，在酸性环境中为玫瑰色，被还原后则脱成无色。瑰色，被还原后则脱成无色。( (反应式见反应式见P P196196图图) ) 本实验用本实验用本实验
80、用本实验用2,6-2,6-2,6-2,6-二氯酚靛酚在酸性环境中滴定含有二氯酚靛酚在酸性环境中滴定含有二氯酚靛酚在酸性环境中滴定含有二氯酚靛酚在酸性环境中滴定含有维生素维生素维生素维生素C C C C的样品溶液。的样品溶液。的样品溶液。的样品溶液。滴定开始时，样品液中的维生素滴定开始时，样品液中的维生素滴定开始时，样品液中的维生素滴定开始时，样品液中的维生素C C C C立即将滴入的立即将滴入的立即将滴入的立即将滴入的2,6-2,6-2,6-2,6-二氯酚靛酚还原脱色，当样品液中维生素二氯酚靛酚还原脱色，当样品液中维生素二氯酚靛酚还原脱色，当样品液中维生素二氯酚靛酚还原脱色，当样品液中维生素C
81、 C C C全部全部全部全部被氧化时，再滴入的被氧化时，再滴入的被氧化时，再滴入的被氧化时，再滴入的2,6-2,6-2,6-2,6-二氯酚靛酚就不再被还原脱二氯酚靛酚就不再被还原脱二氯酚靛酚就不再被还原脱二氯酚靛酚就不再被还原脱色而呈浅玫瑰色，达到滴定终点。此时，记录滴定所色而呈浅玫瑰色，达到滴定终点。此时，记录滴定所色而呈浅玫瑰色，达到滴定终点。此时，记录滴定所色而呈浅玫瑰色，达到滴定终点。此时，记录滴定所消耗的消耗的消耗的消耗的2,6-2,6-2,6-2,6-二氯酚靛酚标准液量，按公式即可计算出二氯酚靛酚标准液量，按公式即可计算出二氯酚靛酚标准液量，按公式即可计算出二氯酚靛酚标准液量，按公
82、式即可计算出样品液中还原型维生素样品液中还原型维生素样品液中还原型维生素样品液中还原型维生素C C C C的含量。的含量。的含量。的含量。三、器材及试剂三、器材及试剂 1 1、器材：研钵、器材：研钵 吸管吸管(10ml(10ml） 容量瓶容量瓶（50ml50ml） 锥形瓶（锥形瓶（50ml50ml） 微量滴定管（微量滴定管（5ml5ml） 漏斗漏斗 纱布纱布 滤纸滤纸 药物天平药物天平 2 2、试剂：新鲜果蔬样品、试剂：新鲜果蔬样品( (绿豆芽、桔子、青椒绿豆芽、桔子、青椒) )；10%10%盐酸溶液；盐酸溶液；2,6-2,6-二氯酚靛酚溶液二氯酚靛酚溶液( (不得超过不得超过3 3天天) )
83、；1mg/mL1mg/mL标准维生素标准维生素C C溶液溶液( (新配制新配制) )；2%2%草酸溶液；草酸溶液；10%10%盐酸酸化的蒸馏水盐酸酸化的蒸馏水 四、实验步骤 1 1、制备含维生素、制备含维生素C C的样品液的样品液称取称取50g50g绿豆芽绿豆芽(37(37发芽发芽3-73-7天天) )置研钵中研磨，放置研钵中研磨，放置片刻置片刻( (约约10min ), 10min ), 用用2 2层纱布过滤，将滤液层纱布过滤，将滤液( (如混浊可如混浊可离心离心) )滤入滤入50mL50mL容量瓶中。用容量瓶中。用10%10%盐酸酸化的蒸馏水定容，盐酸酸化的蒸馏水定容，混匀，备用。混匀，备
84、用。样品样品( (桔子、青椒桔子、青椒) ) 洗净，吸干水分洗净，吸干水分 称取称取20 g 20 g 加加2%2%草酸溶液草酸溶液10mL 10mL 打成浆状打成浆状 取浆状物取浆状物5g 5g 加加2%2%草酸溶液定容至草酸溶液定容至50mL50mL用用2 2层纱布过滤层纱布过滤 取滤液备用取滤液备用2 2、标定、标定2,6-2,6-二氯酚靛酚溶液二氯酚靛酚溶液取取2ml2ml标准维生素标准维生素C C溶液加入溶液加入9ml9ml的的2%2%草酸溶液，草酸溶液，然后用然后用2,6-2,6-二氯酚靛酚溶液滴定，以生成为微玫瑰二氯酚靛酚溶液滴定，以生成为微玫瑰红色持续红色持续1515秒不退为终
85、点。计算秒不退为终点。计算2,6-2,6-二氯酚靛酚溶二氯酚靛酚溶液的浓度，以每液的浓度，以每 mLmL 2,6- 2,6-二氯酚靛酚溶液相当于维二氯酚靛酚溶液相当于维生素生素C C的的mgmg数来表示。数来表示。同时以同时以10ml10ml的的2%2%草酸溶液做空白试验草酸溶液做空白试验。3、样品液滴定1)1)量取样品液量取样品液10ml10ml于锥形瓶中，用微量滴定管，以于锥形瓶中，用微量滴定管，以2,6-2,6-二氯二氯酚靛酚溶液滴定样品液，呈微弱的玫瑰色持续酚靛酚溶液滴定样品液，呈微弱的玫瑰色持续5 5秒不退为终点，秒不退为终点，记录所用记录所用2.6-2.6-二氯酚溶液的二氯酚溶液的
86、mLmL数。整个滴定过程不要超过数。整个滴定过程不要超过2 2分钟。分钟。( (因为很多干扰性还原物质与因为很多干扰性还原物质与2,6-2,6-二氯酚靛酚的反应比较缓慢二氯酚靛酚的反应比较缓慢) )2)2)另取另取10mL10mL用用10%10%盐酸酸化的蒸馏水做空白实验对照滴定。盐酸酸化的蒸馏水做空白实验对照滴定。3)3)样品液和空白对照各做三份，取其平均值。（当样品中维样品液和空白对照各做三份，取其平均值。（当样品中维生素生素C C含量大于含量大于20mg/mL 20mg/mL 时，两次读数的误差时，两次读数的误差2%2%；当样品中维；当样品中维生素生素C C含量小于含量小于20mg/mL
87、 20mg/mL 时，两次读数的误差时，两次读数的误差5%5%）4)4)计算结果计算结果五、实验结果记录五、实验结果记录五、实验结果记录五、实验结果记录1 1、原始数据记录、原始数据记录样品量样品量W W0 0(g) (g) 标定标定2,6-2,6-二氯酚靛酚溶液时所消耗的二氯酚靛酚溶液时所消耗的2,6-2,6-二氯酚靛二氯酚靛酚体积酚体积S S0 0(mL) (mL) 滴定样品液时所消耗的滴定样品液时所消耗的2,6-2,6-二氯酚靛酚体积二氯酚靛酚体积V Vi i ( (mLmL) )2、数据计算处理 维生素维生素C Cmgmg数数/100g/100g样品样品 = = W= 10WW= 10W0 0/50(g) /50(g) S S1/ S1/ S0 0 （mg/mg/mLmL）VAVA为滴定样品液所用的为滴定样品液所用的2,6-2,6-二氯酚靛酚的二氯酚靛酚的mLmL数数VBVB为滴定空白对照所用的为滴定空白对照所用的2,6-2,6-二氯酚靛酚的二氯酚靛酚的mLmL数数S S为为1mL2,6-1mL2,6-二氯酚靛酚溶液相当于维生素二氯酚靛酚溶液相当于维生素C C的的mg mg 数数(VA-VB)S W 100
