2022年超全干细胞重点知识总结

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1、第九章干细胞第一节干细胞概述一、干细胞 ( stem cells)与个体发育正常生物个体发育的过程是按严格的时空程序进行的一系列细胞分裂、分化和细胞凋亡相互协调作用的结果。从一个受精卵、 全能胚胎干细胞或组织谱系干细胞最终分化为具有独特功能体细胞所组成的组织器官 ,这是一个彼此协调而又制约的复杂过程,这一过程通常被称为发育的遗传程序(genetic program) , 被记录在细胞基因组的结构中。不同物种有不同的遗传程序,这可能是物种在长期进化过程中逐渐形成的。在哺乳动物个体发育的不同阶段,包括胚胎、幼年和成年个体的各个发育时期,都存在着发育潜能参差不同的干细胞。干细胞最终演变为独特结构和功

2、能的体细胞或成熟生殖细胞,这过程即是所谓细胞分化。从分子水平而言,可以认为细胞分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达 ,从而控制专一性蛋白质的合成和排布的结果。对正常细胞分化来说,最重要的是多个基因表达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合,并受不同层次的基因调控网络系统精确无误地调节和控制。干细胞在胚胎和成体组织内部的活动,包括干细胞基本特性的分子机制和调节控制、胚胎细胞的迁移活动、时空程序与相邻胚胎细胞的相互作用,对细胞增殖和分化的关系等,虽已有所了解,但由于技术上的原因,直接证据还很少,因此 ,干细胞增殖和分化问题仍是今天发育生物学研究的主题内容之一.二、干细胞的定义和分类因干细胞是指

3、一类具有自我更新和产生分化后代这两种基本特性的细胞。一个充满生命力的雌雄两性机体都是由两类不同的组织和器官构成的。一类是全部由体细胞组成的 ,另一类是以生殖细胞为主的,也包括一些由体细胞组成的组织和器官构成的。前者是执行机体生命活动各种生理功能的;后者一切都为了保证生殖系统的卵巢和辜丸中的卵子和精子的发育和成熟并延续生命的。对人类来讲,从一个受精卵的单细胞要产生200 多种不同类别的细胞来构成各种组织和器官,必然要靠全能性的早期胚胎干细胞通过自我更新和产生分化后代来实现的。自我更新是指干细胞可进行均等分裂,产生两个遗传特性上完全一样的干细胞,均等分裂是大多数细胞的特性,而产生分化后代指的是干细

4、胞还可进行不均等分裂,产生的两个子代细胞中一个仍是干细胞,而另一个是遗传特性有所不同的,要开始走上分化道路的定向祖细胞。早期胚胎细胞是全能的,它既可产生体细胞,又能产生生殖细胞,这包括从早期的卵裂球和囊胚期的 ICM 细胞以及后来胚胎的3 个胚层已分化后的生殖嵴区的原始生殖细胞;而分化的后代细胞可从包括全能细胞向多能细胞和细胞谱系的各级祖细胞发展,这些细胞仍旧可通过均等和不均等两种分裂方式进行繁殖,一直到最后的终未分化体细胞。干细胞可分为两类:一类干细胞包括从早期囊胚ICM (inner cell mass)细胞分离并在体外培养和建系的胚胎干细胞(embryonic stem cells,简称

5、ES 细胞 )和从胚胎生殖嵴原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC) 分离建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, 简称 EG细胞 ) ;另一类是先在成年组织和器官,以后在胎儿组织被证明其存在,随后个别也在体外培养和建系成功的干细胞 , 称为组织干细胞( tissue stem cells) ,又称成体干细胞(adult stem cells) 。三、胚胎干细胞研究简史哺乳动物早期胚胎体积小,又在母体子宫内发育,因此 ,要在体内对各类干细胞的分化及其机制进行实验研究几乎不可能。从 20 世纪 50 年代开始 ,人们一直在致力于寻找一个既能在体外

6、增殖 ,又具有胚胎细胞全能性(totipotency) 或多能性的 (pluripotency) 并通过适当条件能被诱精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 15 页导分化为各种类型分化细胞的实验模型。20 世纪 50 年代末美国发育生物学家Stevens (1967)将着床前发育阶段的小鼠胚胎(包括受精卵 ) 或 12 天胚龄的胚胎生殖嵴异位移植到同系成年小鼠辜丸或肾脏被膜下,移植后 7 天,发现有 80%接种灶出现并发展为畸胎瘤。从中分离、培养和建立了胚胎性癌细胞(embryonal carcinoma cell, EC)

7、系,揭开了胚胎性干细胞早期研究的序幕。 EC 细胞既具有恶性生长又具有早期胚胎细胞发育多潜能性的双重性质。在20 世纪70 年代 , EC细胞常用作研究哺乳动物发育遗传以及细胞分化的实验模型,并取得了一些重要结果。后因EC细胞核型异常,分化细胞类型有限等缺点而不再被使用。20 世纪 80 年代初 ,英国 Evans和 Kaufman 以及美国Martin 2 家实验室独立地从小鼠囊胚成功地建立了能在体外不断增殖,并维持不分化状态的多潜能胚胎干(ES) 细胞系 ,开创了 ES细胞生物学研究的新时代。但此后ES细胞在其他动物上的分离和建系却颇受挫折,直到 20 世纪 80年代后期才有所突破,见表1

8、9.1。 20 世纪 90 年代初 ,美国 Matsui 等从小鼠9 天胚胎生殖嵴建立了多潜能的胚胎生殖细胞系,同一时期 ,少数其他动物也相继建立了ES 或 EG 细胞系。1998 年美国威斯康星大学Thomson 等人利用36 枚新鲜或冻存的人工体外受精胚胎,获得人ICM 细胞 ,经体外培养后,首次成功地建立了5 株人类ES细胞系 ,同年 , John Hopkins 医学院Shamblott 等人从 5 -9 周人流胚胎的生殖嵴和肠系膜首次培养出人EG细胞系。第二节胚胎干细胞胚胎干细胞又称ES细胞主要是指从早期胚胎的卵裂球、囊胚ICM 细胞分离培养和建系的细胞。而从胚胎生殖嵴中PGC分离培

9、养建成的称胚胎生殖细胞简称EG细胞。 这 2 类干细胞统称为胚胎性干细胞,其最基本的重要特性是具有稳定地在体外自我更新并保持不分化和发育的多能性 ,即可以在体外分化为属于3 个胚层的各种细胞。一、 ES和 EG细胞培养、建系技术体外培养建系ES和 EG细胞的技术以小鼠的最为成熟,成功率最高 ,其基本原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系统。由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,首先要解决阻止其分化、确保维持其全能性或多能性这一关键问题。目前常用的细胞分化抑制物主要有3 种:饲养层细胞 ( feeder layer cells)、 特殊细胞的条件培液(cond

10、itioned medium) ,如 BRL (Buffalo rat liver)细胞条件培液,分化抑制因子(differentiation inhibitory factor, DIF) , 如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF) 。此外 ,也有添加通过gp130 信号转导途径的细胞因子,例如 ,白介素 6 (lL 一 6)、Oncostatin M 和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF) 等同样可达到维持小鼠ES细胞的不分化状态。因此 ,体外培养 ES和 EG细胞可划分为两大类:饲养层培养法和无

11、饲养层培养法。(一)饲养层细胞培养法不论 ES细胞或 EG细胞 ,原代或初期培养阶段一般都需依赖于能分泌使它们在体外存活和增殖所必需生长因子的饲养层细胞。不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同。但都要求在ES或 EG细胞培养过程中的饲养层细胞保持不分裂增殖,而仍然保持细胞的代谢活性。常用的饲养层细胞有下列两种:一种是取自各种品系小鼠交配后12 dpc (days post coitum) 的胚胎成纤维细胞(embryonic fibroblast, MEF) 。经丝裂霉素C (mitomycin C)处理以终止细胞分裂后,用作 ES细胞培养的饲养层。另一种是来自SIM 小鼠(S)胚胎的对硫

12、代鸟嘌岭(thioguanine, T) 和乌本苷 (ouabain, O ) 有抗性的成纤维 STO细胞系 ,主要分泌干细胞生长因子(stem cell factor, SCF) 和白血病抑制因子(LIF)。此外,SL - M220 细胞是小鼠胚胎造血的基质细胞SI/SI4 经基因改造产生专一性跨膜型SCF的细胞系 ,以它作为饲养层更有利于促进EG 细胞生长。用作ES细胞或 EG细胞培养的饲养层的MEF 或 STO细胞均需用10 mg/L 丝裂霉素C在 370C灭活 ,用前经 PBS 彻底洗涤。(二)无饲养层培养法饲养层细胞的制备在一定程度上使ES和 EG细胞培养过程显得较为繁杂。近来以添加

13、某些特精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 15 页定细胞的条件培养液和LIF 生长因子至含胎牛血清(FCS) 的正常培养液 ,借此替代饲养层细胞。有 3 种条件培养液可用于小鼠ES细胞培养 :直接在ES细胞基础培养液中加入重组生长因子和 LIF等。 Buffalo 大鼠肝细胞条件培养液(BRL -CM)。 2 -3 周龄幼年大鼠心肌细胞条件培养液 (RH - CM) 。一般以2 -3 份上述细胞条件培养液加1 - 2 份新鲜的ES细胞培养液 ,再添加 10% - 20%胎牛血清 ,共同组合成无饲养层的ES 细胞培养系统。但往

14、往在胚胎干细胞原代和建系初期缺乏饲养层时,用这种条件培养液培养ES和 EG细胞成功率不高,因此 ,正确使用饲养层细胞和条件培养液在ES/EG细胞建系初期仍是成功的一个关键因素。(三) ES和 EC细胞的体外培养1. ES细胞不同动物 ,甚至同种不同品系动物的胚胎发育速度和方式存在着较大差异,例如 ,猪 ICM 细胞生长与小鼠的不一样 ,其生长速率很慢,且有一个休眠(quiescent)时期。因此 ,ES细胞培养建系需根据各个物种而选择不同发育阶段的早期胚胎。例如 ,一般小鼠多选用3 -4 d 的囊胚或2 - 3 d 的桑椹胚 ,猪取 8 - 10 d 的囊胚 ,绵羊取 8 -9 d 的囊胚 ,

15、人和牛取7 -8 d 的囊胚。同时,经体外受精的胚胎或由核移植获得的重构胚胎在体外培养至所需适当的发育阶段也是选取ES细胞培养的有效材料来源。基本培养液为含15% - 20% FCS 、0.1 mmol/L -疏基乙醇和50IV/mL 青霉素、 50g/mL链霉素的 DMEM 液.将桑椹胚或囊胚接种于预先铺有作为饲养层而无有丝分裂活性的单层MEF 细胞的 35 mm 培养皿中。培养2 -3 天后按下列两种方法之一分离出ICM 细胞进一步培养:方法一：免疫手术法(immunosurgery) 。由于 4 - 4.5 dpc 的小鼠囊胚主要由己分化的滋养外胚层(trophectoderm) 和未分

16、化的ICM 细胞组成 ,前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC) ,能识别其相应抗体和形成免疫复合物,在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。囊胚去除透明带,直接暴露于稀释的兔抗JCR小鼠脾细胞抗血清(抗 H - 2b)。再移到新鲜豚鼠血清中, 囊胚的滋养外胚层细胞呈泡状,发生免疫溶解;而 ICM细胞不具 H -2b 抗原 ,不发生免疫溶解,故细胞完整元损。 ICM 细胞经 Hanks 液洗涤后 ,移至 96孔铺有 MEF或 STO饲养层细胞和DMEM 基本培液的板内进一步培养。方法二 :常规培养。桑椹胚或囊胚在铺有M

17、EF 饲养层的DMEM 基本培养液中 ,未去透明带的桑椹胚或囊胚培养3 -4 d,ICM 细胞团从贴壁的囊胚内长出来。吸出 ICM 细胞团 ,用 0.25% (m/V)膜蛋白酶 (trypsin)和 0.2 mmol/L EDTA 混合消化液在370C 消化 5 min. 部分解离的细胞团移至铺有 MEF饲养层的24 孔培养板 , ICM 细胞首先出现贴壁生长,继续培养4 d,可在一些孔内见到巢状集落生长的ES细胞团。用胰蛋白酶消化巢状ES细胞团 ,并继续培养 ,一般 4 -5 d 间隔用胰蛋白酶消化,克隆和纯化ES细胞 ,视 ES细胞密度逐渐转移到较大容积的培养皿或培养瓶。ES 细胞在培养过

18、程中,有时在巢状干细胞团周边出现少量分化细胞,这时除了需继续维持饲养层细胞外 ,在培液中再添加适量的LIF生长因子 ,可克服细胞进一步分化的现象。但有的物种例如猪 ICM细胞对 LIF并不敏感 ,难以抑制其在体外分化,巢状集落形成率很低, LIF不适用。ES 细胞常用培养基的添加物除胎牛和小牛血清外,主要有多种生长因子,例如表皮生长因子(ECF) , 可促进细胞DNA合成和mRNA转录 ,使细胞周期的S期提前 ,周期缩短 ;胰岛素样生长因子( ICF)对 ICM 细胞有促进增殖作用; 干细胞生长因子( SCF) 对干细胞有调控和促分裂作用,同时可抑制细胞凋亡。此外 ,在培液中还需添加还原剂-巯

19、基乙醇 ,可使血清中的含硫化合物还原成谷胱甘肽 ,以消除 ES细胞培养过程中产生的毒性过氧化物,同时 ,-巯基乙醇有诱导细胞增殖和促进胚胎细胞贴壁作用。近来注意到血清可抑制一些种类ES 细胞形成克隆。因此,根据不同物种ICM 细胞在体外生长状况,需要对基本培养液中的各种添加物作适当调整。2. EG细胞哺乳动物 PGC细胞最早发生于近尿囊基部的卵黄内胚层内,随着胚胎发育和纵向转折,卵黄囊的一部分成为胚胎的后肠,PGC细胞也随此经背侧系膜向生殖嵴移动。因此, PGC取材主要根精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 15 页据其在不同

20、物种的早期胚胎中所处迁移位置而定。小鼠 EG细胞建系基本过程如下：收集8. 5 - 10. 5 dpc 小鼠胚胎 ,在解剖镜下用镊子剖取包含原始生殖细胞 (PGC) 的生殖嵴组织， 以 0.02% EDTA 液孵育含PGC细胞的生殖嵴组织, 37 0C , 15 min。吸管轻吹打散,接种于铺有MEF 或 STO饲养层细胞的4 孔培养板内。接种细胞首先出现贴壁生长 ,每天或隔天更换培养液。生殖嵴组织培养物在饲养层细胞上分裂增殖,4 - 6 d 后在显微镜下将包含原始生殖细胞的细胞团用胰蛋白酶消化并转移至新的饲养层细胞上,继续培养增殖。重复用胰蛋白酶消化并移至新的饲养层细胞,经过同上2 -3 次

21、过程 ,一般可产生巢状(nests)生长的干细胞集落。最后将它转移到铺有饲养层细胞的培养瓶内进一步扩增。EG细胞的饲养层常用STO细胞 ,培养液基本同ES细胞 ,但除 LIF外还要添加干细胞因子(SCF) 和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 。二、 ES和 EG细胞系基本特性(一)体外能无限增殖建系后的ES 细胞在体外培养不仅能存活,还能无限增殖,这是干细胞自我更新基本特性在体外培养中的延续。假使在培养条件合适时,ES 细胞可以在体外无限增殖。但实际上,传代次数愈多 ,ES细胞会像常规细胞一样,出现核型不正常的情况,并失去了ES细胞原有的一些重要特性。 129 品系小鼠的ICM 细胞是非常容

22、易建立的ES细胞系 ,而其他品系的小鼠就不那么容易了 ,说明遗传因素是制约ES细胞建系成功与否的一个条件。ES细胞和 EG细胞来自不同的发育阶段 ,在遗传上是有区别的,如 EG细胞的胰岛素样生长因子受体基因甲基化印记修饰等,这在人和其他大动物可能一样。猪EG细胞我们已建系成功,但猪 ES 细胞只能在体外短期存活,还未能建系。关键可能还是培养系统不合适。表明同一品系的ES和 EG细胞的培养建系条件也并不相同。(二)体外产生分化细胞ES 细胞的这个重要特性同样是干细胞产生分化后代这个基本特性在体外培养中的延续。由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,因此 ,ES和 EG 细胞体外培养的首要条件是建立适

23、合其增殖、抑制其分化、确保维持其多能性的培养体系。ICM 细胞一般接种于铺有灭活的小鼠MEF 细胞作为饲养层的琼脂平板上,加有含抑制分化的LIF的培养液 ,或再添加适当的分化诱导物质 (如维甲酸等 ) ,或通过悬滴培养成拟胚体(embryoid bodies, EB) 等特定的条件下,都极易分化产生包括3 个胚层的各种类型的分化细胞,常见的是几种类型细胞混杂在一起,单一类型的细胞要靠定向诱导分化。EG细胞的分化细胞也属于3 个胚层的 ,但工作和分化细胞种类的报道都比较少见。从 1981-2003 这 20 余年中 ,这 2 类胚胎干细胞所分化的细胞都是体细胞,未见有分化为生殖细胞的报道。这样人

24、们就自然形成了胚胎干细胞是多能性 (pluripotency) 的概念。 2003-2004年国外发表了几篇文章,证明体外培养的ES细胞能产生雌、 雄两性的生殖细胞,过去要证明体外培养的ES和 EG细胞是否具有发育全能性,要靠把带有各种标记的干细胞注射至囊胚,再通过种系传递实验先寻找干细胞嵌合到卵巢或辜丸的动物,再通过育种寻找干细胞参与卵子或精子的动物 ,并作纯系繁育,对大动物来说 ,这种嵌合体实验要花大量人力、物力和二三年时间才能完成。 现在能在体外用实验证明培养的ES细胞具有发育为精子和卵子的能力,实现了体外培养的ES细胞也能表达 全能性 (totipotency) 概念 ,这不能不说是E

25、S细胞体外定向诱导分化的一个重大突破。目前个别实验室已先后得到相同的结论,今后若能有更多类似工作的重复和考验 ,必将使干细胞研究推向新阶段。(三)体内产生畸胎瘤ES和 EG细胞若接种于免疫缺损小鼠(裸鼠或 SCID小鼠 )腋窝下 ,或接种于同种同基因小鼠的皮下、眼窝和器官包膜下,均可形成由内胚层、中胚层和外胚层多种类型细胞构成的畸胎瘤。后者通过组织学检查, 可以用作分析和鉴定ES或 EG细胞的发育多潜能性,判断所产生分化细精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 15 页胞种类的多寡。(四)巢状生长有多能胚胎干细胞分子标记ES和

26、EG细胞在体外彼此呈现单层或多层紧密堆积,而形成岛状或巢状集落群体的生长形态。将这种岛状或巢状群体细胞的克隆挑出,用胰蛋白酶轻度消化后接种于新的饲养层或特定的条件培养液中 ,继续培养3 -4 天后 ,分散的 ES细胞或 EG细胞又重新长出彼此紧密接触的岛状或巢状群体细胞克隆。根据经验,用 dispase 酶代替胰蛋白酶消化可使EG细胞少受损伤 ,集落形成率较高。因此,呈巢状集落生长是ES和 EG细胞最具特征性的生长方式。但是,不同动物ES和 EG细胞巢状集落是有所不同的。例如,猪 EG细胞也有自身的形态学特性,猪 EG细胞集落常是圆的 ,比小鼠ES和 EG细胞集落较扁平和较不透明。在扫描电镜中

27、,猪 EG 细胞彼此比小鼠的更具有粘附性,难以解离 ,再培养的种植率也比大多数小鼠ES和 EG细胞的低得多。小鼠、 猪和包括人类在内的灵长类动物的ES和 EG细胞都具有特征性的多能胚胎干细胞的分子标记 , 主要的分子标记列于表19.2.除牛的 ES细胞不表达碱性磷酸酶(AKP)活性外 ,其他动物和人的ES或 EG细胞都表达AKP的活性。分化的ES或 EG细胞都不表达AKP 。因此 ,AKP活性可作为ES或 EG细胞是否分化的重要标记之一。胚胎发育阶段特异性抗原(stage specific embryonic antigen, SSEA) 是早期胚胎细胞表面的一类糖蛋白,不同种类的SSE A

28、因糖基化不同而区分为SSE A -1、 SSEA -3 和 SSE A -4不同的表位分子。未分化的早期胚胎细胞SSEA呈阳性 ,而分化的细胞为阴性。人和灵长类ES细胞表达SSEA -3 和 SSEA -4,而 SSE A -1 仅在人 EG 细胞及刚开始分化的ES细胞中表达。 小鼠的 ES和 EG细胞只表达SSE A -1.肿瘤相关抗原 (tumor related antigen, TRA)是一种对唾液酸酶敏感的细胞表面糖蛋白,生殖细胞肿瘤标记 (germ cell tumor marker, GCTM) 是另一类抗原决定簇不同于TRA的细胞表面糖蛋白。人及猴的ES细胞与 TRA -1 -

29、60、TRA -1 - 80 和 GCTM -2 抗体均可起反应。人与猴是近亲,因此 ,人与猴的 ES细胞都表达TRA分子 ,而啮齿动物小鼠却缺(见表 19.2) ,推测 TRA可能是灵长类多能胚胎干细胞特异性的分子标记。Oct -4 是生殖系专一性转录因子,在小鼠胚胎发育早期、生殖细胞谱系以及体外培养的多能胚胎干细胞中特异地表达,被认为是全能和多能性的一种标志基因。小鼠、猪和包括人类在内的灵长类动物的ES和 EG细胞都表达Oct - 4(表 19.2) 。(五)染色体数目和核型正常无论是小鼠或人的ES和 EG 细胞 ,经体外传代培养后,具有正常的染色体数目和二倍体核型,即使冻存复苏后应仍然保

30、持这种特性。这里,冻存与复苏的条件是非常重要的,对不同的ES和 EG细胞都应专门做实验寻找最合适的冻存和复苏的条件。新建立的 ES细胞系常有不正常的核型 ,因此 ,需对新建系的ES细胞进行染色体数目和核型进行分析确认,特别是为遗传操作所用的 ES细胞 ,染色体数目和核型必须正常。同时 ,与普通培养细胞一样,ES和 EG细胞经体外长期培养、冻存、复苏和传代,染色体和核型也会发生变化。因此,长期培养的ES和 EG细胞也应做染色体数目和核型检查。(六)遗传可操作性ES 细胞遗传操作的可行性是由于ES细胞在体外可以不断地自我增殖,又是具有发育的全能或多能性 , 并能通过构建嵌合体而产生有功能的生殖细胞

31、。这为通过基因工程途径改造物种提供了独特的、无与伦比的受体细胞,小鼠的 ES细胞的实践也证明了这一点。一般体细胞由于增殖能力差 ,基因修饰或改造的效率比ES细胞的低得多。ES细胞遗传操作主要有2 类方法：一是通过同源重组技术去剔除ES细胞基因组的一个目的基因,所谓基因剔除(knock out)途径 ,其二是转染一个外源基因定点整合到ES细胞基因组的正确位置,即所谓基因定点敲入(knock in)技术。常规基因随机整合技术缺点很多,不仅易导致内源有利基因结构失活和破坏,或者激活有害基因 (如癌基因等 )。 而且导入的外源基因的表达水平也难以预测,导致可能产生异常表型的转基因动物。 总之 ES细胞

32、的遗传可操作性已成为胚胎干细胞生物学的另一重要的特性。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 15 页(七)形成嵌合体实现种系传递参与嵌合体实现种系传递是ES细胞生物学的又一重要概念。这在前面已有提及,只有通过形成嵌合体实现种系传递即要分析干细胞是否能参与形成生殖腺中卵子和精子才能鉴定体外培养建系的ES和 EG细胞是否具有全能性。自从20 世纪 80 年代初小鼠胚胎干细胞建系以来,这技术是一直被沿用的,但小鼠 ES细胞的生殖细胞嵌合率要高于小鼠EG细胞很多 ,其他动物的这类嵌合率与小鼠ES细胞相比较的材料也没有。对大多数动物而言

33、从胚胎的ICM 细胞和胚胎生殖嵴原始生殖细胞得到的体外培养建系的ES和 EG细胞都应具有上列7 点基本特性 ,这也是 ES和 EG细胞建系的鉴定指标。人 ES和 EG细胞除了第七点因伦理道德原因不能实施外基本上也具有上述基本性质。三、 ES和 EG细胞定向诱导分化(一)基本原理细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分子细胞学过程。早在20世纪六七十年代前,实验胚胎学家就发现蛙类早期原肠胚(gastrula)的背唇 (dorsal lip)的背方区域能够诱导外胚层分化为神经管,而靠近腹侧面则诱导出尾部结构。接着又发现胚胎发育中组织发生和身体构造形成是一连串的诱导连锁过程,例如神

34、经组织听囊形成后,则诱导邻近的间质细胞形成软骨囊;水晶体则剌激覆盖的外胚层诱导出角膜。在体胚胎的细胞分化过程中, 诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性,同时也决定于被诱导细胞的反应能力( competence) , 后者受遗传、发育潜能等内在因素的限制。诱导物质的专一性和被诱导细胞的反应能力必须在时空上相互巧妙配合,才能保证被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化。ES 细胞是体外研究诱导分化的较理想的模型。其在体外被诱导分化的途径可能不一定与在体胚胎细胞的完全相同,但在实验操作时,也应同时考虑诱导物的性质和ES细胞本身所具的反应能力这两个基本问题。在胚胎细胞被诱导分化实验中,所用诱

35、导物质种类繁多,诱导模式也不尽相同,难以归类论述。但按作用机制大致可分为两类。一类是使被诱导细胞可逆性地轻度损伤:例如无机物、有机酸、醇、亚甲基盐、硫氢化物、氨水甚至蒸馏水或缺钙的盐水,都能使两栖类胚胎细胞渗透压改变致成轻度损伤,导致神经细胞分化。另一类诱导物,如类固醇激素、维甲酸衍生物(RA等) ,多肽生长因子 (bFGF、TGF 、Activin)等,则是通过其与被诱导细胞表面各自的受体结合而介导的细胞诱导分化。同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造,问题较复杂,不仅涉及诱导剂的浓度差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等,而且也可能与被诱导细胞本身的发育潜能和对诱导剂的反应性等

36、差别有关。ES和 EG细胞定向诱导分化是当前ES细胞生物学研究中的热点之一。(二)定向诱导分化的类型体 外 定 向 诱 导 分 化 可 分 为 谱 系 分 化 (lineage differentiation)和 定 向 分 化 (committed differentiation) 两种类型 ,第一种谱系分化包括ES细胞经谱系祖细胞(lineage progenitors)、谱系定型细胞 (lineage committed cell) 到终末分化细胞的整个细胞分化的全过程。在这过程中,会出现一些不稳定的、过渡型的前体细胞。研究和分析这种过渡型的前体细胞,对认识组织谱系细胞的分子和细胞水平分

37、化机制和全过程是有帮助的。但因为细胞呈一过性或连续性,定性和判断的标准尚有待探索。同时 ,由于 ES细胞也是一种具有不受约束的和无序的自我发育特性 , ES 细胞在体外被诱导时常同时出现不同胚层类型的多种分化细胞,这也增加了识别谱系祖细胞和谱系定型细胞的困难性。谱系诱导分化的途径可用于细胞分化的基础研究，但有关报道并不多。第二种定向分化则要设法控制ES细胞导向产生单一类型的终末分化细胞,这是当今临床细胞移植或细胞治疗迫切需要的,也是至今报道较多的,但仍未完全解决的、探索中的难题。根据国外报道和我们的经验,对 ES细胞转染细胞专一的转录因子、标志基因或有关细胞分化因子等遗传操作,并结合报道基因和

38、添加特定细胞因子诱导条件选择等手段,可精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 15 页能是探索ES细胞定向诱导分化的一条有效途径。(三) ES细胞体外诱导分化的基本途径1.单层 ES细胞培养和诱导分化单层 ES细胞在撤除LIF并添加适当浓度的细胞分化诱导剂,如维甲酸 (retinoic acid, RA) ,二甲亚砜 ( DMSO)和环六亚甲基双乙酰胶(HMBA)等并添加适当的生长因子条件下,每隔 2 天,更换含诱导剂的新鲜培养液。细胞分化类型随诱导剂和生长因子性质及其浓度,细胞浓度 ,培养条件等因素 ,特别是ES细胞本身的分化

39、潜能和特性而异。通常单层培养的ES细胞较难分化为单一类型的细胞 ,常出现以某种类型分化细胞为优势的情况下,杂有一些其他类型的分化细胞。因此 ,单层 ES细胞培养途径的定向诱导分化已不多见。2. ES细胞拟胚体形成和诱导分化通过形成拟胚体方式是目前ES细胞定向诱导分化的最基本的常用途径。有两类方法可使ES细胞形成拟胚体。(1)软琼脂培养ES 细胞经胰蛋白酶消化,吹打成单个细胞,接种于预先以软琼脂铺底的培养皿内,ES 细胞呈悬浮生长 ,增殖 ,彼此粘附聚集而形成拟胚体。(2)悬滴培养ES 细胞经胰蛋白酶消化,制备成单个细胞悬浮液,滴种在直径为10 cm 培养皿的盖子上,制成许多悬浮细胞小滴,培养皿

40、内加入适量PHS, 然后小心盖上带有许多小滴的盖子,使盖子上的许多小滴倒置成悬滴。培养皿边缘用parafilm 封起来 ,避免小滴枯干,置 370C ,5% CO2培养箱。培养 3 天后 ,悬滴中的ES细胞聚集形成拟胚体。将拟胚体移至含细胞分化诱导剂(如 RA)的培养皿或微孔板进一步培养。然后移放人铺有0.1%白明胶的培养皿或微孔板内,在含有或不含细胞分化诱导剂 ,并缺乏LIF 的培养液中进一步培养,可被诱导分化为不同类型的细胞,除了直接分化为终末分化细胞外,也可能在适当的条件下,先分化为过渡型的前体细胞或组织谱系干细胞。悬滴培养法形成的拟胚体的形状和大小较软琼脂层上的更为完整均一,重复性也很

41、好。(四) ES细胞体外诱导分化的几种细胞人类 ES/EG细胞建系成功 ,各国科学家正借鉴小鼠ES细胞体外诱导分化的成功经验,致力于将人 ES 细胞改造成以临床基因、细胞治疗和组织工程种子细胞为目的的各种定向诱导分化细胞研究。 有关体外诱导分化的报告仍以小鼠ES细胞为模型的居多,而且大多还是偏重于混合型分化细胞的描述性资料。目前至少有20 余种从 ES细胞诱导分化而来的体细胞在多家实验室获得成功 ,特别是近年几篇有关ES 细胞在体外可分化为生殖细胞的报道,从实验上证明了ES细胞的全能性的性质(表 19.3) 。ES细胞研究中 ,造血细胞 (hematopoitic cell) 是报道最多的一种

42、分化细胞类型。小鼠ES细胞拟胚体在体外可分化为类似于早期胚胎卵黄囊血岛样的结构,分化产生红细胞、髓细胞和淋巴细胞等各种造血系统的细胞。一般常采用分阶段诱导小鼠ES细胞分化为造血干细胞和B 淋巴细胞 :首先使 ES细胞发育成拟胚体,然后 ,用胰蛋白酶消化成单个细胞,经干细胞因子 (SCF) 、血小板生成素( TPO) 和胚胎细胞的条件培养液处理,使其定向分化为造血干细胞;再用原代骨髓基质细胞作饲养层和SCF及 IL-6 细胞因子处理,可进一步使ES细胞来源的造血干细胞分化为 B 淋巴细胞系。根据小鼠ES细胞体外分化为造血细胞的研究,发现 ES细胞体外分化为造血细胞体系一系列发育顺序类似于在体胚胎

43、的发育过程。在体胚胎研究表明, 7.5 d 的小鼠胚胎最初在卵黄囊(yolk sac)内出现大而有核的前成红细胞。当胚胎长至10 -12 d 肝形成时 , 则卵黄囊前成红细胞逐渐消失。这表明胚胎造血器官是从卵黄囊转移到胚胎肝脏的。而在ES细胞体外分化实验中,生长 4d 的拟胚体首先出现前成红细胞,拟胚体生长至第10 -12 d时前成红细胞逐渐消失。 成熟红细胞和成髓细胞都是在前成红细胞出现后不久才产生。利用骨髓基质细胞或其条件培养液,可以诱导小鼠ES细胞在体外分化为造血干细胞。这一重要进展为分精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，

44、共 15 页析研究 ES细胞分化为造血干细胞的早期决定以及分化机制和过程提供了实验模型。小鼠在体胚胎的卵黄囊血岛内,前成红细胞的产生总是伴随着内皮细胞的出现,因而普遍认为内皮细胞和前成红细胞来源于共同的祖细胞。同样 ,ES细胞体外分化时,拟胚体的血岛样结构中前成红细胞集落周围也有内皮细胞出现。ES 细胞衍生的拟胚体分化的管状结构是由内皮细胞排列组成的,管道内还含有一些造血细胞,类似于胚胎发育中的早期血管发生。近年 ,笔者实验室利用具过度表达转化生长因子1 (transforming growth factor 1 , TGF 1)的小鼠 ES细胞 ,在含维甲酸 (RA)培养液中经悬滴培养先形成

45、拟胚体, 再继续贴壁培养,发现拟胚体周围呈辐射状长出许多血管样结构。表明 ES细胞中过度表达的TGF1 在血管形成中起着重要作用。利用外源重组TGF 1 添加至培养液 ,同样也能诱导内皮细胞组成的血管样结构。血管发生是一个极为复杂而有序的细胞生物学过程。TGF 1 是血管发生中的重要调节因子,但在体外也可抑制内皮细胞增殖;另一方面 ,细胞外基质成分的结构三维性(立体 )对内皮细胞粘附、伸展、移动、增殖和生物合成都有明显效应。将ES细胞单层培养在含重组TGF 1的 I 型胶原蛋白为基质的三维系统内,或直接将过度表达TGF 1的 ES细胞单层培养在I型胶原蛋白为基质的三维系统内都能获得内皮细胞组成

46、的血管样结构,而缺乏重组TGF 1 处理或无过度表达 TGF 1 的正常 ES细胞在 I 型胶原蛋白为基质的三维系统内培养,都不能形成血管样结构。因此 ,TGF 1 可能是通过细胞外基质行使其形成血管的功能;此外 ,用重组TGF 1 处理的 ES细胞中 ,能检测到碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 基因表达 ,所以 ,TGF 1 可能调节 ES 细胞和 /或其分化细胞的bFGF基因表达。从而提示bFGF可作为血管内皮细胞的生长因子之一 ,促进内皮细胞分化和形成血管。单层培养的小鼠ES细胞的诱导分化实验中,在 10mol/L 维甲酸 (RA)与 1 mmol/L 双丁酰基环腺昔磷酸 (dibut

47、yryl cyclic adenosine monophosphate, dBcAMP )共同作用下 ,90% -95%的分化细胞 为 神 经 胶 质 细 胞 。 小 鼠ES 细 胞 也 可 在 体 外 被 诱 导 分 化 为 少 突 神 经 胶 质 细 胞(oligodendrocytes ) 和运动神经元。 ES细胞拟胚体在特定条件贴壁培养时也能被诱导分化为神经元。用悬浮培养4 d 的拟胚体在含RA的培养液中继续培养4 d,再使拟胚体贴壁培养则可高效重复地分化出神经细胞,不仅表达专一性的神经微丝M 和微管蛋白 ,还有钠、 钾、钙等离子信号通道的特征。分化的神经细胞还表达神经递质GABA、g

48、lycine 和受体 NMDA 等不同物质。甚至在体外诱导分化早期的拟胚体中检测到神经元和神经胶质细胞的共同前体细胞的专一性标志巢蛋白(nestin)。用RA 诱导ES 细胞分化为表达-氨基丁酸的神经细胞植入Huntingtons病(一种遗传性舞蹈病)大鼠模型体内 ,具有神经细胞功能的移植物使患鼠症状有所改善 ,并存活了6 周。因此 ,ES细胞体外诱导分化细胞有可能成为临床细胞治疗的移植物来源的新途径之一。这些工作都表明通过用某一简单的化合物,有可能激活ES细胞基因组中一套仅用于神经细胞分化的基因,而抑制了沿着其他细胞类型分化途径中应表达的基因。近年来, ES细胞在体外定向分化为多巴胶能神经元

49、已取得了重大突破,这对神经发生的基础研究和临床神经细胞移植具有极重要的意义。悬浮或悬滴培养的小鼠ES细胞的拟胚体在RA 诱导条件下贴壁生长数天,常出现某些分化细胞集落具节律性自发收缩现象,显然是肌细胞。 电镜观察证实 ,收缩的细胞内存在着肌原纤维、肌小节和闰盘等典型心肌细胞特有结构。发现心肌细胞分化过程中,分化细胞团刚开始收缩时型肌球蛋白重链(MHC)表达占优势 ,继续培养数天,则型MHC 逐渐占优势 ,最终在分化的心肌细胞中 ,27 %表达型MHC ,33 %同时表达和型MHC ,40 %表达型MHC。这种MHC 亚型的转变与在体胚胎心肌发育过程极相似。除心肌细胞外,决定骨骼肌发育的基因my

50、f-5、myogen in , myoD 等在 ES细胞拟胚体的分化细胞中都能够表达,而且表达时序与在体胚胎发育中相同。ES细胞拟胚体贴壁培养1- 2 周后一般都能出现肌细胞,继续培养则融合成肌管 ,显示出骨略肌发育的典型特征。分化的肌细胞常表达成熟肌细胞专一的Ca2+信号通道和烟碱受体 (nicotinic receptor) 。二甲亚砜诱导ES细胞拟胚体可形成心肌、平滑肌和骨倍肌精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 15 页等多种类型肌细胞,用肌肉专一性的调节因子myoD 基因转染 ES细胞并结合DMSO诱导处理 ,额外表

51、达 myoD基因的 ES细胞 ,则主要分化为骨骼肌,没有心肌和平滑肌类型细胞出现,且骨骼肌常融合形成肌管。 因此 ,看来通过改造ES细胞某种基因和给予适当培养条件的途径,是诱导ES细胞向特定单一类型细胞分化的可行方法之一。小鼠ES细胞或 EG细胞通过悬滴培养法,形成的拟胚体被转移到铺有琼脂的培养皿中,悬浮培养3 d, 每天更换含有诱导剂二甲亚砜(DMSO)的培养液。 3 d 后,经过诱导剂处理的拟胚体移人表面事先用明胶(gelatin)包被的培养皿中进一步贴壁培养。这时给培养液中加入胰岛素、三腆甲腺原氨酸(triiodothyronine) 和胎牛血清 ,10 -15 d 后大部分拟胚体分化为

52、脂肪细胞。脂肪细胞中的脂滴含有甘油三酯(triglycerides) , 很容易用油红O (oil red O) 染色鉴定 ,显示特异性红色。笔者实验室曾用RA 替代二甲亚砜诱导剂,其余条件同上,约 60%以上的 EG细胞拟胚体可被诱导分化出脂肪细胞。ES细胞诱导分化为软骨细胞的条件较为苛刻,一般成功率也较低。 小鼠 ES细胞通过形成拟胚体并结合添加转化生长因子家族(如 TGF 1 ,BMP-2和 BMP-4)可诱导分化为表达软骨相关基因和蛋白的软骨细胞。ROSA -geo 基因转染的小鼠ES细胞 ,在缺乏 G418 的情况下聚集成拟胚体。用10%小牛血清代替胎牛血清,培养液中含有分化诱导剂1

53、 mol/L地塞米松(dexamethasone) ,2 - 3 d 更换培养液 ,50 d 后,这种拟胚体发育成软骨细胞,经 Alcian blue 液染色,显示出明确的软骨细胞特征,细胞间存在着11 型胶原。小鼠 ES细胞经过拟胚体阶段,结合无血清和多种生长因子、有丝分裂原处理,可被诱导分化为分泌胰岛素的、类似胰岛的结构。近来利用人ES细胞经过悬浮培养获得胚体,再经如bFGF等生长因子诱导可分化为以产生胰岛素为特征的胰岛样细胞,为临床糖尿病的细胞治疗提供了细胞来源打下基础。ES细胞定向诱导分化为肝细胞已有少数几篇报道。国内蒯小玲等成功地用RA、肝细胞生长因子(HGF)、 -神经生长因子(-

54、 NGF)共同添加至细胞培养液,被诱导分化细胞从形态学、生化和肝细胞功能性标记等指标都证明是具有功能性的肝细胞。但仅使用RA,虽能分化为上皮样细胞 ,可是并不表达各种肝功能的生化指标,例如 ,白蛋白、 AFP、G-6-P、 1-AT 、肝核因子-4 和 SAPK/ERK 激酶 -1 (SEK1) 等 ,表明HGF和 -NGF是诱导小鼠ES细胞分化为功能性肝细胞的重要因子。 在现阶段 ,通过不同的诱导途径可将ES细胞诱导成肝细胞。但体外诱导 ,体内诱导以及体内外相结合的诱导分化,总的来看 , ES细胞定向分化为肝细胞的分化率和在体内与正常肝的嵌合率都还不高,这是一个急需解决的问题。由于 ES细胞

55、易进行遗传操作,近年日本科学家Toyooka将标记基因GFP或 lacZ定点敲人 (knock in) ES细胞 Mvh 基因 (在生殖细胞分化中特异表达的基因)位点 ,用以 ES细胞体外分化期间追踪生殖细胞的产生。体外ES细胞形成拟胚体时,出现 Mvh 阳性的生殖细胞,与分泌骨形态发生蛋白 (BMP4 )的细胞共培养下,可促进这种Mvh 阳性生殖细胞分化。将这种Mvh 阳性生殖细胞接种人CD - 1 (ICR)裸鼠辜丸被膜下,可进一步分化成熟为精子。同年早些时候,美国Hubner 等人也报道了小鼠ES细胞在体外可发育为进入减数分裂期的卵原细胞(oogonia) ,在体外观察了卵子发生( oo

56、genesis)过程。第三节成体干细胞20 世纪初 , Pappenheim 根据对骨髓中的造血细胞发生过程的形态学观察,提出了骨髓中存在着未分化干细胞的设想,认为未分化的干细胞通过各个中间阶段的前体细胞最终生成成熟的多种类型血细胞。第一次提出了成体干细胞(adult stem cell) 的概念。成体干细胞是指一群分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新潜能并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞的干细胞,故又名组织干细胞。实际上,成体组织中存在干细胞是个体发育进化史的产物, 涉及组织器官的再生能力和创伤修复等基本特性。例如 ,骨髓组织的造血干细胞可分裂、分化为血液系统的各种细胞 ,定期补充细

57、胞成分或失血。小肠和皮肤中的干细胞也分别能分化、补充和更新小肠和皮肤组织的一些细胞。传统的观点曾认为,干细胞一精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 15 页旦分化成熟 ,就不再分裂增殖了;人体除了血液、皮肤、消化管上皮和肝脏的组织干细胞有一定的再生能力外,其他组织器官例如神经组织基本上不再具有再生能力。同时也认为在成体中存在的、属于某组织器官的成体干细胞是专能或限能的,例如造血干细胞只能分化为血液系统的各种细胞等。但是,新近的研究表明,这些成体干细胞的发育潜能可跨越组织或胚层的界限。例如 ,从成年小鼠脑组织分离的神经干细胞移植

58、入经X射线照射过的小鼠骨髓部位,则分化出血液细胞。此后,发现人和小鼠的神经干细胞具有分化为肌细胞和胚胎多种组织细胞的潜能。看来 ,神经干细胞随着微环境条件的改变,其分化潜能会有所变化。因此,神经干细胞同样具有可塑性,能分化为非神经类型的细胞。人们把成体干细胞具有跨越组织或胚层分化的这一特性称为干细胞的可塑性(plasticity) 或跨越分化 (transdifferentiation). 这些新概念从根本上动摇了早先经典的关于组织干细胞分化的胚层限制理论。成体干细胞分化的多能性表明：当机体需要的时候,细胞的命运不是一成不变的。成体干细胞可以多向分化 的多潜能性的发现,不仅从理论上改写了组织特

59、异性干细胞只能向特定方向分化的传统概念 ,而且还为许多疾病的细胞治疗提供了新的思路和有希望的前景。目前 ,比较一致的看法是：成体干细胞是一种处于尚未终末分化的、处于干/ 祖或前体细胞状态的成体细胞 ,它来源于成年和未成年个体的组织干细胞。在正常生理条件下,倾向于分化成并更新所在组织的各种细胞。但在特定的外界条件诱导下,一种组织的成体干细胞能超越该特定组织、胚层分化成其他组织的功能性细胞,补充参与其他组织损伤的修复等。一、成体干细胞具分化可塑性在成体干细胞的研究中,近年来最重要的发现是干细胞具有可塑性( plasticity) 。证据大多数来自小鼠的实验 ,人们确信机体中成体干细胞的可塑性现象具

60、有普遍性。(一)骨髓干细胞骨髓是由不同类型多种细胞成分组成的组织,除了分化的血细胞和间质细胞外,其中主要有二类成体干细胞： 一类是造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC), 能生成各种血细胞;另一类是间质干细胞 (mesenchymal stem cell, MSC) ,能生成内皮细胞、脂肪细胞和成纤维细胞等。一些实验室通过全骨髓移植实验证明,骨髓中的细胞在不同微环境的位点,除了形成各种血细胞和衍生于间质干细胞的各类细胞外,还可以被诱导分化为神经细胞、肌细胞、 骨和肝细胞等外、中、内 3 个胚层的不同类型的分化细胞(表 19.4)。证明骨髓组织中含有的干细胞具有多

61、潜能性,在特定的条件下可跨越组织或胚层分化的能力,能够分化为内皮、神经元、 胶质细胞和肝细胞等。目前已知道骨髓中存在着造血干细胞(HSC) 和间质干细胞(MSC) 两类干细胞 ,为区别这两类干细胞在分化潜能上的不同,便把骨髓干细胞分离和纯化。体外培养的骨髓细胞,HSC 细胞呈悬浮集落生长 ;而 MSC细胞则贴壁生长,通过换液很容易把两者分开。发现两者也都具有多潜能性。1.间质干细胞从骨髓组织分离的MSC 细胞在体外单独培养时,经证明具有分化为包括骨细胞、软骨细胞、腱、脂肪细胞和肌细胞等潜能,也能分化成内皮细胞和内胚层的肝细胞。MSC 细胞移植至脑中,可分化为非间质细胞性质的神经细胞,特别是神经

62、元、 神经胶质细胞。 当 MSC细胞注射入早期囊胚 ,然后移植入假孕母鼠,分析嵌合体动物,发现 MSC细胞可参与大多数(但不是所有 )体细胞类型的分化;当 MSC 细胞移植入正常宿主时,则除了肝、肺和肠的上皮外,主要分化为造血细胞的谱系世代。当MSC细胞移植入小量射线照射的宿主,则造血系统和胃肠道组织有所增加。2.造血干细胞在成体干细胞中,HSC 细胞是研究得最早和最多的一种异质性很强的干细胞。由于已知HSC细胞表面存在着一些标志,可用流式细胞仪或免疫磁性分选技术从骨髓细胞中分离和纯化出精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共

63、15 页HSC细胞。经移植至不同的体内微环境,可分化为三胚层的各种类型细胞,包括心肌、 骨骼肌、血管内皮系统 ,肝细胞、肺泡、食管、肠道、胃、胆管以及皮肤和神经细胞等。因此,骨髓中的 HSC与 MSC一样 ,分化潜能具有很大的可塑性,可分化为跨越胚层的各种类型细胞。HSC细胞在体外培养时,发现血细胞系之间,即淋巴细胞系与髓性细胞系之间和系内也存在分化方向的转变。(二)神经干细胞受经典的造血发生和无脊椎动物神经发育研究的启示,发现了神经干细胞。起初,把神经发育过程中未成熟的、增殖中的各类细胞称为神经前体细胞(progenitor cell) 。因此 ,神经干细胞是神经系统中一类能自我更新并产生神

64、经元和神经胶质细胞的前体细胞。早期研究是从哺乳动物胚胎的中枢神经系统和周围神经系统开始的,确证了胚胎的神经系统中普遍存在着这类神经干细胞。其后,进行成体神经干细胞分离,发现成体神经干细胞主要存在中枢神经系统的2个神经发生区域： 即脑的海马区 (hippocampus) 和次脑窒区 (subventricular zone, SVZ )以及包括脊髓等其他一些非神经性的区域。总而言之 ,神经干细胞或神经前体细胞在个体发育过程中,经受发育上的时空变化,成体神经干细胞的可塑性受到限制。通过个体不同发育阶段的神经干细胞移植至宿主不同部位,可以发现 ,神经干细胞移植物分化为神经细胞的潜能具有发育阶段的依赖

65、性,成体中的神经干细胞分化潜能随发育遂受到限制。用成体中枢神经系统的干细胞经体外培养扩增的移植实验表明,其在成体微环境中尚有一定的可塑性。例如,成体脊髓衍生的干细胞通常不产生神经元,若注人成体脑的海马区,则能产生神经元;成年海马衍生的干细胞移植入SVZ, 则能产生嗅球神经元。然而 ,至今却没有直接证据表明成体神经干细胞分化为如在胚胎中正常产生的有突触的神经元。当然 ,移植的神经干细胞或神经前体细胞在宿主不同部位也会受到所在微环境各种因素的相互影响 ;神经干细胞经体外不同方式处理后移植至宿主体内,也可能会改变其分化行为和表型。倘若神经干细胞分化潜能被限制,这些限制能否撤消?即成体干细胞能否重新获

66、得如在胚胎正常所产生各类细胞的能力?现有的研究资料表明,把体外培养的SVZ干细胞生长成神经球通过注射入鸡胚神经嵴(neural crest)途径 ,其分化潜能有所扩大,可产生周围神经系统。另外,神经干细胞的子代也有可能恢复发育多潜能性。例如,通常唯一产生神经胶质细胞的视神经O2A 中枢前体细胞在体外可恢复其多能的、产生中枢神经系统的干细胞。表明环境因子能改变神经干细胞的命运或增加其可塑性。(三)肝干细胞由于肝干细胞本身缺乏特异性标志,给肝干细胞分离和鉴定带来了困难。人们对肝干细胞存在与否一直有争论,直到最近才得以确认。早在1958 年 , Wilson JW 等人认为 肝组织中存在着干细胞 ,

67、其依据是肝组织因营养损伤或部分切除时仍能再生,但已存在的肝细胞不能分裂和再生 ,因而 ,新生的肝细胞只能来源于肝干细胞。肝癌发生的研究也支持了肝干细胞存在的假设。化学致癌实验时,位于门管周围的小细胞发生增殖,这种具有卵圆形细胞核、少细胞质的细胞称为卵圆形细胞(oval cell)。在人的肝组织中,同样发现这种卵圆形细胞。对发育中的肝具有自我更新能力的细胞进行单克隆培养和分析,证明这种卵圆形细胞在体外能大量增殖,细胞移植后在形态和功能上可分别分化为肝细胞和胆管上皮细胞,表明肝卵圆形细胞是肝干细胞 ,具有分化为肝细胞和胆管上皮细胞的双潜能性。近来发现,骨髓和血液中的细胞能分化为肝细胞 ,因此 ,肝

68、干细胞来源可能有两条途径：一是肝组织外的来源,近年越来越多的资料证明,骨髓和血液是卵圆形细胞的来源,人的骨髓细胞也能分化为肝细胞和胆管上皮细胞;二是肝组织内处于休眠期的肝干细胞。双潜能的肝干细胞同时表达肝细胞和胆上皮细胞的标志物,细胞角蛋白CK7 和 CK19为胆上皮细胞的特异性标志;白蛋白和肝代谢酶细胞色素P450可作为肝细胞的特异性标志物;而细胞角蛋白CK8和 CK18在肝实质细胞和胆上皮细胞都有表达。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 15 页角蛋白CK14 可区分单层和复层上皮细胞。OV-6 抗体是啮齿类卵圆形细胞

69、的特异性标志物,但不是人肝干细胞的标志,原因不清楚。肝干细胞一般除了其特有的形态学外,常结合上述特有标志通过免疫组织化学、流式细胞检测和原位杂交等方法予以鉴定。双潜能卵圆形细胞不仅能分化为肝细胞和胆管上皮细胞,当分别移植到胰腺和十二指肠时,还能跨越组织各自分化为胰腺细胞和肠上皮细胞。表明肝干细胞在适当的微环境能被诱导分化为仍是内胚层其他组织的细胞。但还未见有跨胚层分化的直接例证。但是,利用胚胎的肝组织在体外培养则大量生成血细胞,但很难说明这些血细胞就是来自肝干细胞,很可能这些血细胞是来自胚胎肝组织中混杂的造血干细胞。卵圆形细胞异常分化或分化突然停止有可能发生肝细胞癌。 国内外曾有报道,在培养液

70、添加适当的分化诱导剂,如丁酸钠或二甲基亚砜,可诱导和促进肝干细胞分化为肝细胞。在培养液中添加转化生长因子(TGF)或肝细胞生长因子(HGF) ,可诱导肝干细胞分化为胆管上皮细胞。因此,结合细胞分化诱导物等培养条件,有可能使肝干细胞定向分化为肝细胞或胆管上皮细胞。(四)骨骼肌干细胞肌肉的生长、 更新和修复是与肌纤维周围的卫星细胞(satellite cells)有关 ,故一般认为这就是骨骼肌干细胞。 近年证明 ,从肌肉分离的干细胞不仅能分化出肌肉,还能产生血液细胞成分。Jiang等人从3 天龄的新生小鼠前后肢近端分离和体外培养骨骼肌细胞,得到一类被称为多能成年前体细胞 (multipotent

71、adult progenitor cells, MAPC)的细胞。这种细胞具有类似于小鼠骨髓MAPC的表型和特征 ,能在体外增殖。 肌肉来源的MAPC在体外特定的细胞因子条件下可被诱导分化成内皮、 肝细胞样细胞和包括进一步分化为神经元及神经胶质样细胞的神经外胚层细胞。表明骨骼肌组织中确实存在着干细胞,并具有分化的可塑性。二、成体干细胞研究中的问题(一)异质性实际上 ,成体干细胞在组织中的所含数量极少,又缺乏特异性检测标志,很难从组织中将其分离纯化出来。因此,在一些成体干细胞可塑性 的实验中 ,人们质疑所谓可塑性 可能是组织中混杂着几种或一群不同类型的干细胞而分化的结果,这在骨髓组织的干细胞实验

72、中更为明显。在肝细胞谱系分化的各类祖细胞中,就发现存在着异质性(heterogeneity) 和可塑性。干细胞的异质性在遗传学中是指由于不同遗传机制而产生相同或类似的表型。异质性在某种程度上是干细胞固有的特性。造血干细胞异质性早已被证明。从骨髓肌干细胞的研究中发现,这类所谓的肌干细胞在特定环境下分别分化出肌肉和血细胞,其实这是由含有两类分化方向完全不同的干细胞所致。这一实验结果使得成体干细胞可塑性 理论受到质疑和动摇。人们也曾设想成体组织中存在着类似胚胎干细胞那样的多能性干细胞。Zuk等人 (2001)发现 ,从人体脂肪组织来源的干细胞可分化为肌肉、骨和软骨。 但该作者指出不排除该组织中混入了

73、诸如随血流循环进人脂肪组织的造血干细胞(HSC) 或其他类型干细胞的可能性。因此,无法确证这类分化为肌肉、骨和软骨的就是脂肪干细胞 。也有人相信来源于肌肉组织的多能干细胞 其实就是随血液循环迁移或过客(itinerate) 而停留在肌肉的造血干细胞。因为当这些细胞被移植入动物体内,在内皮细胞生长因子等细胞因子的剌激下,会被重新激活而分化为血细胞。甚至估计小鼠体内有100 -400 个 HSC细胞处于这种状态。目前还不能确定成体干细胞的可塑性是否因干细胞异质性直接所致,因此 ,要明确一种干细胞与其组织来源及归宿之间的确切关系 ,还得进行大量的研究。(二)干细胞所处的环境小鼠造血干细胞和胰腺干细胞

74、都能分化出肝细胞并能修复小鼠受损的肝组织。但是,移植造血干细胞和胰腺干细胞对修复小鼠受损肝组织的效果远远不如移植成熟肝细胞本身。看来干细胞所处环境的信号对于细胞分化有重要影响。特殊稳定的微环境可以控制造血干细胞生长和分化 ,这种微环境在早期被称为壁鑫(niche)。现在微环境定义为能容纳一个或多个干细胞精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 15 页并能控制其自我更新和分化的组织细胞和胞外基质的组合。它是由各种调控活性成分组成的空间 ,细胞间保持的距离以及局部的近距离调控正适合于细胞间相互作用。从视网膜再生研究中发现一个很有趣

75、的现象。将视网膜祖细胞分离出来在体外培养一些时间后,分化为视网膜感受器细胞。如果从小鼠眼中分离的干细胞移植入正常小鼠视网膜,它们将不能分化和被整合入正常视网膜;而当移植入损伤的视网膜中,则分化为感受器细胞,并整合入该受损组织,尽管尚未确证这类整合入的细胞是否具有正常细胞的功能,但组织环境确实对干/祖细胞的命运有决定性的作用;同时 ,也不可忽视干 /祖细胞本身对所处环境信号的反应能力。众所周知 ,脊髓产生的运动神经元具有对来自各组织的信号具有反应的能力;从鼠脑中获取的神经干细胞在体外因中断了来自大脑的信号刺激,故在体外培养条件下,只能一过性地分化为多巴胶能神经元 ,不能维持长久的多巴胶能神经元的

76、功能。因此,干细胞与所处的细胞环境之间精巧而默契的协调作用可能是干细胞可塑性 的重要原因之一。(三)成体干细胞可塑性的调控目前认为 ,人们对成体干细胞可塑性 现象的解说有4 种：机体中存在着多种来源和不同分化方向的成体干细胞群体,分别能定向地向各自的组织来源的细胞分化。机体中存在着一种多潜能的成体干细胞,在不同的微环境信号的刺激下,可向不同组织的细胞方向分化。某特定组织来源的成体干细胞,除了向该组织的细胞成分分化外,在特殊信号的剌激下,可重新编程 (reprogramming), 继续分化为其他类型的细胞。某种成体干细胞与特定组织来源的干细胞发生融合,成为具有来自2种细胞的遗传物质,染色体数量

77、也是正常2倍的 杂交细胞 。但使前者具有了后者的分化潜能,因此 ,成熟的干细胞也许无法变成不同类型的细胞,但它们可自动与现有的干细胞融合,形成其他组织类型的细胞。例如神经干细胞与造血干细胞融合,从而 变性 为血液干细胞,分化为各类血细胞。正如上所述 ,干细胞的 可塑性 一方面与其所处微环境密切相关,即受到外源性因素调控;另一方面也受到成体干细胞本身对这类外来信号做出反应的固有特性即内源性因子调控。外源性因素通常指各种体液因子、邻近同种或异种细胞的直接接触、细胞外基质等的作用。至今大多数干细胞的可塑性研究是基于组织损伤而造成的微环境,因而人们正把注意力集中在组织损伤后的微环境对干细胞的调控作用。

78、在内源性调控机制中,一般认为转录因子在其中起着重要的作用。细胞分化中,一个已明确定向分化程序的谱系特异性转录因子过表达会致使该谱系特异性转录因子功能发生颉顽作用,并使原有的基因程序活性保持沉默。这样,这类细胞对微环境中特定细胞因子的反应是分化成另一类新细胞。例如,在成肌细胞分化中,转录因子MyoD 和 Myf5 起着调控成肌细胞调控因子 (myogenic regulatory factor, MRF) 网络中的颉顽作用。 在成纤维细胞中, MyoD 的过表达可致使这类细胞转变为成肌细胞,同时 , Myf 5 又抑制成肌细胞的分化活性。然而 ,在某些情况下,这一过程却是可逆的。在转基因C2C1

79、2细胞的肌管形成中,同源异形框基因的异位表达降低了成肌细胞调控因子MRF 和 MyoD 表达水平 ,致使多核的肌管去分化而转变成单核的细胞, 进一步再分化为软骨细胞、脂肪细胞等中胚层类型的细胞。(四)分化细胞的功能目前成体干细胞包括可塑性 的研究的结果大多数是基于检测新生组织中终末分化细胞的特定蛋白或标记的表达,很少直接论及到终未分化细胞的生理功能。然而,有的不同类型的细胞却具有相同的标记, 例如 ,内皮细胞与成熟血细胞亚群表面标志都有CD31,甚至 HSC表面也有 CD31,因此 ,选用 CD31作为进行分析HSC能否分化为内皮细胞时,显然是不合适的。 不少人对仅仅检测到某种标志就证明该细胞

80、或组织具有正常细胞功能的做法常持有质疑;特别是干细胞的异质性和类型以及环境的复杂性使得人们对体外培养的干细胞移植入体内能否发挥预期功能表示怀疑。确实,目前在技术学上还无法适当地证明成体干细胞在所移植的组织或器官中产生出来的细胞具有功能性,例如 ,在研究帕金森氏病的动物实验中,体外培养的多巴精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 15 页胶能神经元移植入脑内,可观察到被整合入动物脑组织,但不能证明这些新的神经元是否具有完整的功能。因此,欲要确定供体干细胞的终末分化状态应该包括细胞表面标志鉴别和细胞功能确定这2 方面因素。例如,神

81、经干细胞移植后，可塑 为血细胞 ,既要鉴定出分化细胞具有血细胞的表面标志,又要肯定使已接受致死辐射剂量照射过的受体小鼠存活并使造血功能恢复。只有这样,才能完整地确定干细胞的分化细胞特性和功能。(五)体外增殖成体干细胞从某一组织分离、纯化后,目前 ,尚未有现成的能较长期在体外维持其未分化状态并大量增殖的方法。 因大多数成体干细胞研究是用于再生医学作细胞治疗的目的,常设计使用两种手段 :其一是将分离的成体干细胞直接移植入动物或患者的损害组织器官,以期在受损组织原位分化出该组织中成熟的功能性的细胞;其二是在体外将干细胞诱导分化为所需要的成熟细胞 ,而后将细胞移植入损害组织或器官。鉴于成体干细胞很难分

82、离、纯化和体外培养,因而 ,目前这两种手段都不能奏效。一个典型的例子是将烫伤患者的、含有皮肤干细胞的健康皮肤切取下来,进行短暂体外培养,再重新植回患者的皮肤损害部位,发现尽管皮肤可愈合,但不能产生汗腺和毛孔,无法行使正常功能。由于在体内观察组织行为极为困难,而且得到的结果不确定因素较多,因而 ,继续探索成体干细胞体外培养和增殖的条件和方法,将是一项极为重要的课题。第四节干细胞在再生医学中的应用干细胞 (包括胚胎干细胞)生物学研究的最新进展,使人们对干细胞独特的生物学特性有新的了解。成体干细胞的可塑性 或跨越分化 潜能的发现具有重要的理论意义和应用价值。不仅向传统的细胞分化和细胞周期理论提出了挑

83、战,而且成体干细胞在细胞生物学行为上与癌细胞很相似 ,成了研究癌症发生机制新的生长点。在再生医学中可望利用成体干细胞修复创伤、疾病的细胞治疗并介入整形外科学和组织工程学等方面,其中除了神经干细胞作为脑损害的细胞治疗研究有较多的报道外,大部分工作集中在组织工程学领域,干细胞在生物和再生医学中的应用主要有下列4 方面。一、哺乳类发育的体外模型如前所述 ,体内研究哺乳动物胚胎发育和各类细胞分化极为困难。干细胞 ,特别是 ES细胞因其富具独特的发育全能或多能性质,在嵌合体动物中,ES 细胞又能参与个体发育,并产生包括生殖系在内的各种类型细胞,表明 ES细胞类似胚胎的ICM 细胞 ,不仅具有完整的发育潜

84、能性,而且也持有对调节正常发育所有信号的应答能力。在特定的体外培养条件和诱导剂共同作用下,ES细胞在体外可被诱导分化属于3 个胚层谱系的各种高度分化的体细胞,例如神经细胞、肌肉、血细胞、上皮细胞和成纤维细胞等。同时,在这些细胞分化过程中,必然先经过一定的前体细胞阶段。 因此 ,ES细胞不仅是研究特定类型细胞分化的模型,而且也是研究某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系。可能ES细胞体外分化途径和机制与在体胚胎的不完全相同 ,但在分子水平包括发育的遗传程序仍有共同或相似之处。小鼠的卵受精后的卵裂期较长 ,约 3 天才到达16 细胞期 ,进一步分裂 ,约在 4.5 dpc 时形成囊胚。 这

85、时胚胎出现第一次分化 ,产生以后参与胚外结构的滋养外胚层和原始内胚层。胚泡内约由20 个左右细胞组成内细胞团 (ICM)。胚胎进一步增殖和空腔化(cavitation) , 约在 5.0 dpc 时逐形成原始外胚层或上胚层 (epiblast) ,后者在原肠期除了主要发育成胎儿本体的3 个胚层组织外,还有部分细胞将来参与胚外中胚层的发育。悬浮生长的体外细胞拟胚体在结构排列上与在体胚体的有些不同,但一些类型的细胞分化秩序和方式却非常类似于在体的胚体。因此小鼠 ES 细胞已被公认为是研究哺乳类发育较理想的模型。人 ES细胞建系后 ,一些国家的法律和道德伦理禁止用于人体胚胎研究。 但近来认识到,ES

86、细胞本身缺乏胚外组织,不可能产生完整的胚胎。因此 ,许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下,已允许将人ES细胞类似于小鼠ES细胞的体外实验那样,用于研究人类胚胎在体内所不能分析的发育、分化和调节信号等事件。这无精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页，共 15 页疑将丰富、充实和完善人们对人类早期发育或畸胎发生等认识。二、介导改造动物的基因ES细胞介导的转基因优点明显超过常规如逆转录病毒载体整合至早期胚胎或显微注射DNA至受精卵原核等一般转基因方法,主要是因为在后一途径中,导人的多拷贝DNA 存在着随意整合的问题 ,产生的

87、转基因动物效果一般不太理想。利用 ES细胞技术学的优点是在于产生一种新的经生殖系传递的转基因动物以前,可以通过在体外ES 细胞系统中,研究和筛选外源DNA 表达质粒的构建、整合和表达。 从而可提高产生转基因动物的效率;同时 ,ES细胞在体外增殖迅速 ,可作为重组ES细胞取之不尽的来源;ES细胞的基因改造技术,如剔除 (knock out)、 敲入(knock in)能够精确地改造细胞内存在的基因,克服位置效应、插入失活和特殊内源性基因失活等弊病。重组ES细胞的基因组经生殖系传递途径,可不断地提供和产生同样基因型的、丰富的转基因动物的种子细胞来源。近年来,在制备转基因动物出现了一个新的策略利用体

88、外培养的体细胞经外源基因转染后,取其细胞核显微注射至去核卵细胞,从而获得转基因动物,这一技术路线显然比直接显微注射DNA至去核卵细胞效果更好,特别是对那些至今还未建立ES细胞系但核移植已获成功的那些动物。三、人体的基因和细胞治疗干 细 胞 生 物 学 技 术 和 理 论 的 发 展 ,促 使 医 学 产 生 了 一 门 新 的 学 科 分 支 ,即 再 生 医 学(regenerative medicine) 。它是一门探索人体组织和器官自身所具有的构建、更新和修复的能力,并使用多种修复术手段使人体的组织器官功能得以改善或恢复新兴学科。干细胞的基因和细胞治疗则是再生医学的重要组成部分之一。这里基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者体内,达到控制和治愈疾病为目的的治疗手段,又称细胞治疗。 人 ES细胞经遗传操作后一般能稳定地在体外增殖传代,克服了目前基因治疗中需大量靶细胞来源的主要问题。四、组织工程的种子细胞来源精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 15 页，共 15 页