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1、学习必备欢迎下载生物技术制药第一章 绪论生物技术与生物技术药物的概念生物技术药物的分类按用途分类 ：治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA 芯片 ) 按作用类型分类：细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、 RNA 干扰 (RNAi) 药物、基因治疗药物按生化特性分类：多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG) 化多肽或蛋白质药物生物技术药物的特性理化性质特性：相对分子量大、结构复杂、稳定性差药理学作用特性：活性与作用机制明确、作用针对性强
2、、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性生产制备特性：药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染质量控制特性：质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等) 第二章基因工程制药蛋白类药物的特点：结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性临床前安全性评价的特殊性：蛋白类药物安全性担忧的性质和来源；受试物的纯度；相关动物的选择；给药剂量的选择；免疫原性；遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验)；药代动力学真核细胞表达制品的安全性问题：生产细胞 DNA 残留
3、的影响、生产用血清的影响基因工程药物稳定性研究的相关问题：药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH 基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性基因工程菌的修饰改造方法：构建突变体、构建融合蛋白、PEG 修饰 (降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2) 基因工程制药基本环节上游阶段：制备目的基因构建重组质粒构建工程细胞下游阶段：培养工程细胞分离纯化产物除菌半成品、成品检定包装基本工具： 目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞酶切结果 ：5粘性末端、 3粘性末端、平头末端1U 核酸内切酶的酶活性：指在最佳反应条件下反应1 小时，完全水解1mg 标准 D
4、NA 所需的酶量影响限制性内切酶反应的因素：DNA 样品的纯度：DNA的甲基化程度：核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA 。酶切反应的温度DNA 的分子结构反应缓冲液组成反应时间、反应体积等工具酶核酸限制性内切酶：识别、水解外源的双链DNA 分子上特定的核苷酸序列。主要存在于原核微生物中。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 21 页学习必备欢迎下载? 同裂酶：指来源不同，识别序列相同的酶；进行同样的切割，产生相同的末端? 同尾酶：来源不同，识别序列不同，但产生相
5、同的粘性末端DNA 甲基化酶：具有宿主专一性，对宿主自身DNA上特定核苷酸进行甲基化修饰，避免被自身限制性内切酶水解DNA 连接酶? T4 噬菌体连接酶：连接双链DNA 切口，或带粘性末端或平头末端的DNA 片段?大肠杆菌DNA 连接酶： 连接双链DNA 切口，或带粘性末端的DNA 片，不能连接带平头末端的DNA片段聚合酶：以 DNA 或 RNA 为模板，将核苷酸连续加至3-OH 末端，合成方向为5 3。 DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶? 大肠杆菌DNA聚合酶： 5 3 DNA聚合酶活性；5 3 DNA外切酶活性；3 5DNA 外切酶活性； RNA H 酶活性? Klenow酶：不具备5 3
6、DNA 外切酶活性? T4 噬菌体DNA 聚合酶：不具备5 3DNA外切酶活性。外切酶活性比Klenow酶强 200 倍，对单链 DNA 作用强于双链DNA ? T7 噬菌体 DNA聚合酶：不具备5 3 DNA 外切酶活性? Taq DNA聚合酶? 反转录酶：催化以RNA 或 DNA 为模板，合成DNA ；具有 RNA H 酶的活性? 末端脱氧核苷酸转移酶：催化dNTP 沿 5 3 聚合，逐个加于线性DNA分子的 3末端；不需要模板载体： (vector)来源于质粒、噬菌体或病毒的DNA分子 ，可供插入或克隆目的基因或DNA ，并具有运载外源 DNA 导入宿主细胞的能力。质粒载体： 共价闭合环
7、状DNA(cccDNA)；开环 DNA(ocDNA)； 线状 DNA(lDNA)? 质粒的三个重要性质：遗传传递的能力；遗传交换的能力；不相容性? 用于克隆的质粒的三个要素：复制子、选择标记、多克隆位点? 常用质粒载体：克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体噬菌体载体： 插入型载体、置换载体? 来源于噬菌体DNA ，因可以插入较大DNA 片段，常用于构建基因组文库和cDNA文库。目的基因的常用制备方法化学合成法：前提：基因的DNA的序列已知。小于100bp的片段：直接合成，最常用固相亚磷酸三酯法。 大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法PCR 法： 前提：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧
8、的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。基因文库法：鸟枪法：适用于原核细菌目的基因的克隆分离cDNA文库法 (与 mRNA互补的 DNA) 并非所有的mRNA 分子都具有polyA结构；仅限于克隆蛋白质编码基因； mRNA含量少且t1/2短，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难第一链： mRNA模板，引物(polyT) ，逆转录酶，dNTPs 第二链：自身引导法：取得的双链cDNA5 端会有几对碱基缺失(NaOH ，煮沸； Klenow酶， dNTPs ；S1 内切酶 )引导合成法：获得的 cDNA能保持完整的5端序列 (TdT, Dctp；NaOH ；退火； Klenow酶，dNTPs)
9、基因文库的完备性：指在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N 之间的关系可用下式表示：N= ln(1 P) /ln(1 f)，P=完备性， f= 克隆片段的平均大小/ 生物基因组的大小双酶切产生的粘性末端，最常用，可以确保连接方向的正确性影响连接效率的因素：连接方式；目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1；连接温度、时间、酶的活性、反应缓冲体系重组 DNA 导入宿主细胞导入大肠杆菌：CaCl2法；转染法精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 21 页学习必备欢迎下载导入酵母 ：电转化法；化学转化法；原生
10、质转化法导入链霉菌 ：原生质转化法；电穿孔法重组 DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法；DEAE 葡聚糖转染法；DNA- 磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；电穿孔法；细胞融合法；病毒感染法重组子的筛选与鉴定遗传标记筛选法：抗生素抗性筛选法；互补筛选法(蓝白斑筛选载体含有LacZ 基因， X-gal培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑)；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法核酸分子杂交法：菌落原位杂交法；DNA 印迹法； RNA 印迹法限制性内切酶图谱法：琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆DNA 序列测定法目的基因表达产物测定法原核细胞表达的特点及选择大肠杆菌 (首选 ,遗传背景研究清楚
11、；适合大规模生产(成本低，周期短，效率高，操作简单)、芽孢杆菌、链霉菌等缺点：缺乏翻译后修饰系统；容易以包涵体形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系统水解 外源基因表达的调控原件：复制子、 启动子(表达效率的关键因素 )和终止子 、核糖体结合位点(即 SD 序列及 SD 序列到起始密码子AUG 的距离 )、识别翻译后修饰信号用于原核表达的载体必须具备的条件：具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子、阻遏子 (一般有 )、强的终止子，所产生的mRNA 应具有翻译起始信号(起始密码子AUG 以及SD 序列 ) 外源基因在大肠杆菌中的表达方式胞内表达：非融合蛋白表达：蛋白质接近天然状态，易
12、被降解，易形成包涵体。有原核多肽基因融合蛋白表达：表达效率高；产物稳定；可以切除原核多肽，获得天然外源蛋白分泌表达：有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达 外源蛋白表达效率的影响因素外源基因密码子：大肠杆菌具有偏好密码子和稀有密码子，外源基因应尽量设计成为大肠杆菌的偏好密码子mRNA 的结构 ：改变一级结构；降低5端二级结构稳定性；调控3端非翻译区二级结构表达载体的选择：表达方式；强的复制子(拷贝数高 )；强的启动子 (转录效率高 )；高效率的核糖体结合位点；强的终止子(提高 mRNA 稳定性 )；适应范围广；稳定性高；产物易纯化。外源蛋白的稳定性：采用融合蛋白形式表达；采用蛋白酶缺陷的突变菌
13、株真核细胞表达的特点及选择常用的真核表达系统：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统大肠杆菌和酵母表达系统的比较大肠杆菌巴斯德毕赤酵母载体原核载体穿梭载体调控序列原核原核和真核表达形式包涵体、融合蛋白、分泌分泌翻译后修饰基本无有生产方式发酵，操作简单、经济发酵，操作较简单、较经济 酵母表达体系的影响因素外源基因的结构精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 21 页学习必备欢迎下载外源基因5端非翻译区的序列和长度影响mRNA 的翻译效率起始密码子两侧若容易形成RNA 二级结构，将阻止翻译进行富含 A-T 序列导致转录
14、提前终止密码子的偏好性高度复杂的胱氨酸结构基序影响表达效率表达形式及信号肽的选择：无信号肽常胞内表达；有信号肽，胞外分泌型表达启动子 ：多数毕赤酵母采用乙醇氧化酶AOX1 、AOX2 启动子转化子的拷贝数：拷贝数越高，表达水平也越高诱导条件 ：甲醇诱导的浓度、时间以及温度的选择外源蛋白的降解：采用酶缺陷型宿主、加入底物蛋白或调节pH 值抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白的稳定性。哺乳动物细胞表达系统表达载体：病毒载体(腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒等)；质粒载体表达方式：瞬时表达、稳定表达、诱导表达基因重组蛋白的主要分离技术：离心、沉淀 (等电点沉淀法、盐析法)、膜分离、双水相萃取基因重组蛋白的主要
15、纯化技术：离子交换层析 、亲和层析 、凝胶过滤层析 、反相色谱和疏水色谱选择分离纯化方法的依据根据表达形式选择分泌型：沉淀和超滤周质表达：溶菌酶处理渗透压休克胞内可溶表达：亲和层析或离子交换层析胞内不溶表达(包涵体 )：易与杂蛋白分开，但需要复性形成有活性的蛋白质。根据分离单元之间的衔接选择先采用低分辨、分离规模大的方法，后采用高分辨的方法，最后采用分离规模小、速度慢的方法。合理选择色谱分离次序根据分离纯化工艺的要求选择具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性；尽量较少组成工艺步骤；所用时间尽可能短；工艺和技术必须高效 基因工程药物的质量控制与小分子药物质量控制相比，不同的方面Mr 远大于小分子
16、化学物质，致使适用于小分子药物的鉴别方法无法用于基因工程药物。如质谱基因工程药物结构复杂，常需多种检测方法两者杂质性质差别较大。小分子药物杂质主要来源于合成中原料残留、合成副产物和纯化中溶剂残留；基因工程药物多为宿主蛋白残留和宿主基因残留，其检测一般都用专用的试剂盒。药物定量方面，基因工程药物一般采用生化反应的方式 基因工程药物的质量控制1、蛋白质含量的测定紫外吸收光谱：在 280nm有最大吸收值。快速，无破坏性。不是严格定量，核酸可引起强干扰作用。BCA 法：碱性条件与Cu2络合同时将Cu 2还原成 Cu(双缩脲反应 )，再与二辛可宁酸形成紫色复合物，在562nm有最大吸收值。需短时间10m
17、in内完成Lowry法：碱性条件蛋白质与铜形成复合物可还原磷钼酸磷钨酸试剂，产生深蓝色。特点：灵敏，准确度高；操作步骤多，繁琐；影响因素多(盐酸胍、尿素、EDTA 等) 考马斯亮蓝法：灵敏，操作简单，重复性好；抗干扰能力弱SDS-凝胶染色与扫描分析法2、蛋白质纯度的测定：电泳 (SDS-PAGE) 、质谱法 、色谱法 、末端氨基酸分析法3、蛋白质分子量的测定：SDS-PAGE 、凝胶色谱、质谱法4、蛋白质等电点的测定精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 21 页学习必备欢迎下载5、蛋白质序列分析N 末端氨基酸序列分析：鉴定蛋白
18、质的种类；C 末端分析：判断表达、纯化过程中有无加工6、蛋白质二硫键分析7、蛋白质活性的测定8、免疫测定法9、内毒素分析、宿主蛋白和核酸残留分析基因工程药物的实例：干扰素 (IFN)、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(CMCSF) 、人白细胞介素-2(IL-2) 、胰岛素、人生长激素(hGH) 第三章动物细胞工程制药动物细胞的体外培养 体外培养动物细胞的形态：贴壁依赖性细胞，非贴壁依赖性细胞，兼性贴壁细胞贴壁依赖性细胞：成纤维样细胞型(主要来源于中胚层组织)；上皮样细胞型(主要来源于外胚层和内胚层组织 ) 非贴壁依赖性细胞：又叫悬浮细胞，一般呈圆球形。主要来源于血液、淋巴组织、杂交瘤细胞兼性贴壁细
19、胞：如CHO 细胞、小鼠L929 细胞动物细胞的生理特点1) 细胞的分裂周期长，一般为1248h(G1 S G2 M) 2) 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象3) 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的4) 动物细胞对周围环境十分敏感(如渗透压、 pH 、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱) 5) 动物细胞对培养基的要求高(需要 12 种必需氨基酸、8 种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳源的葡萄糖，以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。)6) 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同培养条件要求高、成本贵，产量低；多半是分泌在胞外的，收集纯化方
20、便，得到了较完善的翻译后修饰 动物细胞培养的条件(一)环境条件：直接接触的器材、防止污染(显著地污染标志：pH 值迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现细胞集落 )、水质、 pH( 大多是 7.2-7.4) 、渗透压、温度、通氧量、基本营养物质(二)营养要求：水、碳源、氮源、维生素、激素、无机盐等碳源不能为无机物，大多只能利用葡萄糖氮源不能为无机物，主要利用各种氨基酸在多数情况下，需要添加5 20 的小牛血清，或适量动物胚胎浸出液。培养基：天然培养基，合成培养基，无血清培养基天然培养基 ：主要见于早期阶段，来源：血浆凝块、淋巴液、血清(最常用有效 )、羊水、腹水等。分维持液 (低或不含牛血清)和生长
21、液 (5%-20% 牛血清 ) 合成培养基 ：主要成分：糖、氨基酸、核苷酸前体、维生素、激素、缓冲体系、无机盐等无血清培养基提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批之间差异的影响；减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；供应充足、稳定；细胞产品容易纯化；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 21 页学习必备欢迎下载血清的作用：提供各种生长因子和激素，贴附因子和伸展因子，可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白，必须的
22、脂肪酸和微量元素 其他常用溶液：平衡盐溶液；培养基pH 调整液；细胞消化液(胰蛋白酶， EDTA) ；抗生素溶液动物细胞培养的基本技术和方法 动物细胞培养的方法：原代培养、传代培养、克隆培养细胞的原代培养：组织块培养法、单层细胞培养法。取动物组织块剪碎分散处理(加胰蛋白酶或胶原蛋白和 EDTA) 洗涤纯化计数稀释培养细胞的传代培养：离心或酶消化法收获细胞，计数后，以适当浓度接种到新的培养环境中单克隆培养动物细胞培养的基本技术：细胞分离 (离心法；蛋白酶消化法)；细胞计数；细胞传代；细胞的冻存 (慢冻，液氮,196 度) 和复苏 (快融，投入37水浴融化 ) 冻存主要步骤：活性好的细胞，加保护剂
23、(DMSO等)混合；做好标记(细胞种类、日期等)；逐渐降低温度，最后放至液氮中；降温梯度要合适，总的原则是慢冻生产用动物细胞原代细胞 ：费钱费力，少用传代细胞系：安全，特点：2n 核型，贴壁依赖，接触抑制，有限传代(50 代) 转化细胞系：自发转化或人为转化，失去了正常细胞的特点，可=无限增殖传代，适宜大规模工业培养工程细胞系：融合细胞系 (仙台病毒融合法、聚乙二醇融合法、电融合法)；基因工程细胞系病毒载体：牛痘病毒。腺病毒和逆转录病毒载体，杆状病毒载体-昆虫细胞系统基因工程细胞主要的筛选系统，HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶)选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞GPT(HAT 、
24、黄嘌呤、甘氨酸、霉酚酸)选择系统，筛选gpt+的转化细胞G418(Geneticin)选择系统，筛选Neor的转化细胞MTX 选择系统，筛选dhfr+的转化细胞细胞库的建立：原始细胞库 (MCR) 生产用细胞库(MWCR ，又称工作细胞库，主细胞库生产细胞库) 常用生产用动物细胞：BHK-21 ，C127 细胞，CHO-K1 ，COS 细胞，MDCK细胞，WI-38 ，MRC-5 ， Namalwa，Sf-9，Vero ，SP2/0-Ag14 动物细胞大规模培养 动物细胞的大规模培养方法?悬浮培养：适用于非贴壁依赖细胞或兼性贴壁细胞优点：操作简便，培养条件均一，传质传氧较好，容易扩大培养，可以
25、借鉴细菌培养的经验。缺点：细胞培养密度较低。?微载体培养：用于培养贴壁细胞。充分发挥悬浮培养的一切优点。理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当(1.030 1.045g/ml)、粒径均一，在60250m 之间 (溶胀后 )、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分?多孔载体培养：可用于悬浮细胞及贴壁细胞。细胞在网格内，能避免受到剪切力的损伤，因此培养体系可以提高搅拌速度和通气量。多孔载体的一般条件：具备生物相容性、机械稳定性和热稳定性?微囊化培养：避免剪切力对细胞造成的损伤；获得较高细胞密度107108个/ml ；利于纯化；可采用多种生物反应器进行培
26、养?中空纤维培养：把细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟毛细血管提供营养。理想的动物生物反应器必须具备的基本要求：体系中的各种材料，对细胞必须无毒性。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 21 页学习必备欢迎下载生物反应器结构的传质、传热和混合性能好。密封性能良好，可避免一切外来微生物的污染。培养环境多种物化参数可自动检测和调节控制，控制的精确度高，且能保持环境质量的均一。可长期连续运转，尤其对于动物细胞而言。容器加工制造时要求内面光滑，无死角。拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒便于操作消毒。设备成本尽可能低。 动物细
27、胞生物反应器规模 ：实验室规模：100L 类型 ：搅拌罐式；气升式；中空纤维式；透析袋或膜式；固定或流化床式；一次性摇袋式细胞培养主要操作方式：分批式操作：能够控制的参数只有PH、温度和通气量补料 -分批 (或流加式 )操作： 不断地向系统中补充新的营养成分半连续式操作连续式操作和灌流式操作：后者取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出了部分细胞。转基因动物基本原理及步骤：外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系转基因动物制作方法经典的
28、技术路线：基因显微注射法，最常用、成功的方法，成功率低整合胚胎移植的技术路线：受精卵的成活率高达90以上，外源基因整合率高，提高受孕率核移植 (克隆 )的技术路线：体细胞核移植；核移植前导入目的基因。整合卵受精的技术路线：卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。具体方法：基因显微注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞方法，精子载体导入法、基因打靶法、人工酵母染色体法转基因动物研究出现的问题：制作转基因动物效率低；外源基因在宿主基因组中的行为难以控制；转基因表达水平低转基因动物反应器：(bioreactor)目的片段在器官或组织中表达的转基因动物。如乳腺、膀胱、血液等动物细胞产品制造实例：类淋巴细胞干
29、扰素、组织型纤溶酶原激活剂、单链尿性纤溶酶原激活剂-尿激酶原、促红细胞生成素(EPO) 、凝血因子VIII、乙型肝炎疫苗第四章 抗体工程制药概述抗体工程应用于医学领域：研究，以免疫转印法检测特定抗原；医疗，以毒素连结抗体攻击病变細胞；检验，以ELISA 侦测特定病原体；多克隆抗体 (polyclonal antibody，pAb) 简称多抗 。如:免疫血清 (含多种特异性抗体) 实际意义：预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清(抗破伤风 )；胎盘球蛋白(抗病毒感染 )。副作用：超敏反应。 临床诊断 ，如：肥达氏反应(伤寒、副伤寒)。缺点：特异性差单克隆抗体 (monoclonal anti
30、body, mAb )简称单抗优势 ：特异性高： 只识别某一个特定的抗原决定簇。均一性好： 其 H 链、L 链及 V 区独特性其完全一致，所得到的抗体结构和生物学性状完全一致。杂交瘤细胞 ：既能产生单一抗体，又能无限增殖抗体分子的结构和功能基本结构 : 四肽链结构精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 21 页学习必备欢迎下载重链 (H 链)和轻链 (L 链)天然 Ig 分子中，重链同类，轻链同型。重链可分为五类：、链 IgM 、 IgG 、IgA 、IgD 、IgE；轻链可分为、型。可变区 (V 区)、恒定区 (C 区)和铰链
31、区 (木瓜蛋白酶、胃蛋白酶) VL 、VH 区各有 3 个超变区 (也称互补决定区，CDR1-3) ，共同组成Ig 的抗原识别部位，形成与抗原决定簇互补的表位。可变区中的其它部分变化较小，称为骨架区(FR) C 区决定 Ig 分子的异种抗原性，主要发挥抗体分子的效应功能。抗体分子的价位： 指抗体分子能结合的抗原表位数的多少。VH 和 VL 的 CDR 区共同构成抗原的结合位点，因此一个单体免疫球蛋白分子有两个抗原结合点，故习惯将单体抗体分子称为2 价分子 。单克隆抗体的制备产生杂交瘤细胞的三个关键点：B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特性、细胞融合技术、杂交瘤细胞的筛选单克隆抗体制备的基本过程(理解
32、)：抗体与动物免疫，提取能够产生抗体的B 淋巴细胞， B 淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒/聚乙二醇的诱导下融合，并在特定的选择培养基下筛选出杂交瘤细胞。在体外条件下做大规模培养 /注射到小鼠腹腔内增殖。再提取出大量的单克隆抗体,最后进行纯化。抗原和免疫：抗原的制备 (通常和佐剂混合，增强免疫应答)、免疫动物 (体内 / 体外免疫方法；动物的选择：一般采用与骨髓瘤供体细胞同一品系的动物)细胞的融合和杂交瘤细胞的筛选细胞的融合：制备脾细胞悬液：最后一次免疫后三天，1108个；制备骨髓瘤细胞悬液：对数生长期细胞， (23)107个；融合：4050PEG(MW4000)，37， 5min
33、HAT 培养基筛选杂交瘤细胞HAT 培养基筛选原理：H(次黄嘌呤 )；A( 氨基蝶呤 )；T(胸腺嘧啶 )。骨髓瘤细胞不具备HGPRT 和 TK，B 淋巴细胞寿命短。影响细胞 DNA 的合成： H 促进了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)途径；T促进了胸腺嘧啶激酶(TK)途径；内源性途径(谷氨酰胺、鸟核苷酸单磷酸，二氢叶酸还原酶途径 )被 A( 叶酸的拮抗物)阻断步骤： 融合后细胞HAT 培养基 HT 培养基正常培养基杂交瘤细胞的检测和克隆抗体的检测 ：仅少数杂交瘤细胞可以分泌预期抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)、间接免疫荧光法、放射免疫测定法、流式细胞仪法杂交瘤细胞的克隆：有限稀释
34、法、软琼脂培养法。经过34 轮克隆化，才能达到100 孔内均为阳性细胞克隆。耗时长(34 月) 杂交瘤细胞的冻存：冻存原始细胞单克隆抗体的大量制备：体内接种法 (皮下接种、腹腔接种)；体外培养法单克隆抗体的鉴定和检测单克隆抗体的检测McAb特异性检测 ：检测有无抗原抗体结合；检测有无交叉反应。ELISA、间接免疫荧光法McAb类和亚类的鉴定：类的鉴定一般在杂交瘤的克隆化过程中可以确定(兔抗鼠 IgG或 IgM 作为二抗用于ELISA)亚类的确定需要用标准抗亚类血清系统做双扩散电泳或夹心ELISA。其他鉴定： 中和活性鉴定；识别抗原表位鉴定；亲和力鉴定；效价(滴度鉴定 )；纯度鉴定杂交瘤细胞的鉴
35、定：主要是对杂交瘤细胞进行染色体分析抗体治疗疾病的机制：中和作用、导向作用、拮抗作用、ADCC 、CD 、Aonist 抗体在疾病治疗中的应用作为诊断试剂：病原微生物抗原抗体的检测、肿瘤抗原的检测、免疫细胞及其亚群的检测、激素测定、细胞因子的测定作为治疗药物：抗肿瘤、抗感染、抗器官移植排斥反应、治疗自身免疫性疾病和变态反应性疾病制约抗体药物迅速发展的主要障碍：免疫原性；分子量大基因工程抗体单克隆抗体的人源化精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 21 页学习必备欢迎下载嵌合抗体： 人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定
36、区融合而得到的抗体。特点： 具备亲本鼠源单抗相同的特异性和亲和力；对人的免疫原性大大减少；可以接上不同亚类的人C 区基因，改变抗体功能；半衰期长；工程细胞系比人人杂交瘤细胞稳定；由于鼠VL 和 VH 区的存在，仍有较强免疫原性改形 (型)抗体： 把鼠抗体的CDR 序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR 移植抗体或改形抗体，也就是人源化抗体。，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，小分子抗体包括Fab 、Fv、单链抗体及单域抗体等Fab 片段：由重链V 区及 CH1 功能区与完整的轻链以二硫键连接而成。1/3 Fv 片段：由 VH 与 VL 非共价结合而成。在 VH 与 VL
37、的适当区域个引入一个半胱氨酸，形成链内二硫键，成为二硫键稳定的 Fv(disulfide-stablized Fv，dsFv)1/6 单链抗体 (ScFv)：在 VH 与 VL 之间加上一段连接肽，把VH 与 VL 连成一条单链，即单链抗体。常用的连接肽是 (GGGGS)3单域抗体：即为 VH 或 VL，约为完整分子的1/12 。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。优点：可以用细菌发酵生产，成本低；分子小，穿透力强；不含Fc，没有 Fc 带来的效应；在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶
38、标抗体等。多功能化抗体双功能抗体 (bsAb) ：又称双特异性抗体，两个针对不同抗原决定簇的ScFv 以共价键或非共价键连接在一起。融合抗体： Fc 抗体融合蛋白；Fv 抗体融合蛋白细胞内抗体：指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体，也称内抗体。在scFv 的 C 端/N 端插入其他靶向信号最小识别单位：约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR 构成，它也保持着抗体的特异性噬菌体抗体工程噬菌体抗体库技术的三个关键：RT-PCR 技术；噬菌体展示技术；抗体原核表达技术。 噬菌体抗菌库技术的筛选：。固相或液相纯化抗原的筛选、全细胞筛选、用切片组织进行筛选第五章疫苗及其制备技术1.活疫
39、苗 (live vaccine)选用无毒或弱毒但免疫原性高的菌种，经培养、繁殖后制成的。活疫苗株进入机体后，能继续生长繁殖，对机体呈长时间刺激，持续产生抗体。这类菌(疫)苗有卡介菌 (预防结核病的菌苗)、炭疽菌苗、牛痘疫苗、狂犬病疫苗、鼠疫菌苗、脊髓灰质炎疫苗以及麻疹苗等。2.死疫苗 (killed vaccine)包括灭活疫苗(由完整的病毒或细菌经灭活剂灭活后制成，即要使病原体充分死亡，丧失感染性或毒性和致病性，又要保留其免疫原性)和 亚单位疫苗 (将病原体经物理或化学方法处理，除去无效物质，提取其有效抗原部分制备的一类疫苗) 活疫苗特点死疫苗特点可在体内繁殖系统免疫反应和局部免疫反应免疫力
40、持久，产量高，成本低有毒力增强和反祖危险抗原干扰现象保存条件苛刻不能在体内繁殖，性质稳定，安全性高有利于制备多价或多联疫苗比较安全，不发生全身性副反应，无毒力反祖现象受外界影响小，有利于保存运输免疫剂量大，需多次免疫，成本高只能诱导机体产生体液免疫通常需要用佐剂或携带系统来增强其免疫效果活疫苗死疫苗DNA 疫苗精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 21 页学习必备欢迎下载可在宿主细胞中复制毒力降低免疫反应比较全面免疫剂量小免疫保护期长不能在宿主细胞中复制无毒，不返强免疫反应不太全面不会传染给其它个体制备技术相对容易可刺接抗原在
41、细胞内合成可诱导细胞免疫制备技术容易标准化重组亚单位疫苗将病原的主要保护性抗原蛋白基因在体外进行大量表达，纯化其表达产物辅以佐剂制成疫苗- 亚单位疫苗良好的安全性和稳定性。利用非疫苗用蛋白作为抗原建立的诊断方法将可以区分亚单位疫苗免疫的动物和自然感染的动物适用于发病快，病程急，中和抗体能有效控制发病的传染病。不适于病程发展缓慢，潜伏期长，感染巨噬细胞且有ADE 效应的疾病。活载体疫苗利用低致病力的痘病毒、疱疹病毒、腺病毒或细菌作为载体，将其它病原的主要保护性抗原基因插入到载体基因组的非必需区形成新的重组体，在同源或兼容性好的启动子驱动下随载体的复制表达插入的外源基因。病毒活载体疫苗的缺点：使用
42、同一载体的不同疫苗不能同时使用疫苗制造流程制造优良疫苗的关键：优良的菌种；适宜的培养方法；良好生产工艺；严格的检验和标准。生产工艺流程：菌(毒)种培养物 (培养基、动物、禽胚或细胞等)收获抗原(培养液、含毒组织、胚液或细胞液等 )配苗分装冻干成活疫苗或灭活后制成灭活疫苗。毒种的选择与减毒毒株须具备的条件：1)持有特定的抗原性；2)有典型的形态和感染特定组织的特性，并能保持其生物学特性；3)易在特定组织中大量繁殖；4)不产生神经毒素或能引起机体损害的其它毒素；5)如制备活疫苗，繁殖过程中无恢复原致病性的现象；6)未被其它病毒污染。强毒种的选育：毒力强，纯粹，抗原好，稳定的菌种，最后冻干保藏。这就
43、是强毒菌种的标准弱毒种的选育：初选的依据：生物性状改变细菌灭活疫苗制造：种子培养灭活和无菌检查浓缩提高含菌量配佐剂分装动物安全试验细菌弱毒疫苗制造：菌种培养浓缩配苗和冻干动物安全试验病毒性动物组织苗(自家组织灭活苗；病毒弱毒疫苗)、病毒禽胚疫苗、病毒细胞疫苗、寄生虫疫苗的制备 疫苗产品的质量检定：外观检查、 pH 值检测、 纯度、 宿主细胞DNA 和蛋白残留量、无菌检查、 热原、抗生素检测、灭活效果的验证、异常毒性检查、稳定性试验、效力试验(生物效价)、佐剂的质量评价、疫苗标准品或参考品的研究甲型肝炎减毒活疫苗：生产用细胞 (人二倍体细胞)、细胞库管理及检定、细胞制备、细胞培养液、毒种名称及来
44、源、种子批的建立、对照细胞外源因子检查、病毒接种和培养、病毒提取(检定合格的病毒收获物经冻融和(或 )超声波处理， 并采用适宜浓度的三氯甲烷抽提以提纯病毒)、原液 (同一细胞批生产的病毒收获物经提取病毒后合并为一批原液) 流行性乙型脑炎疫苗：收液作毒力滴定与无菌实验，加入福尔马林，22恒温灭活8d 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 21 页学习必备欢迎下载灭活剂、保护剂和免疫佐剂灭活剂种类1.甲醛溶液 ：最常用。蛋白质核酸烷基化(不加中断剂 )作用于氨基、羧基、羟基、巯基2.烷化剂 ：乙酰基乙烯亚胺(AEI) ；二乙烯亚
45、胺(BEI)；缩水甘油醛。(使微生物核酸烷基化,灭活后加2%硫代硫酸钠中断灭活)。烷化 DNA 分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，妨碍RNA 的合成。使病毒完全丧失感染力，而保留其保护性抗原。3.苯酚 (石炭酸 )：用于防腐，很少用于疫苗研制4.结晶紫 ：蛋白质变性 (溶于有机溶剂)；用于诊断抗原的制备：鸡白痢抗原5. -丙酰内酯 ：病毒灭活剂，主要用于狂犬病灭活苗制备！注意：灭活剂对人有害，有时对皮肤粘膜有强烈刺激性如：甲醛、-丙酰内酯影响灭活作用的因素：灭活剂特异性；微生物种类和特性；灭活剂浓度；灭活温度；灭活时间；灭活PH 值；有机物存在保护剂的用途 菌种或毒种保存：常用甘油作保护剂 细胞株保存
46、：常用二甲基亚砜(DMSO ，一种细胞的保护剂) 疫苗冷冻真空干燥制备时：加脱脂乳(或二甲基亚砜)和蔗糖等 (不同国家有不同配方) 干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖保护剂分类：机理渗透剂(DMSO 、甘油和蔗糖 )非渗透剂 (聚乙烯吡咯啶酮(PVP) 和蛋白质 )；分子量大小高分子物质、低分子物质；化学性质复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物疫苗冻干保护剂组成：营养液；赋形剂；抗氧化剂常用的冻干保护剂(稳定剂 )细菌的保护剂 需氧或兼氧厌氧菌：蔗糖脱脂乳或蔗糖、1.5 明胶； 厌氧性细菌：含1.5 谷氨酸钠的乳糖或10脱脂乳或7.5葡糖血清。注：脱脂乳： 20脱脂奶粉溶于水配制而成。病毒
47、的保护剂 5%蔗糖脱脂乳；马立克 814 活细胞疫苗：保存液氮.稳定剂为10%二甲基亚砜和50%犊牛血清的199 液。注: 微生物保护剂缓冲液的组成比例，不同厂家有不同的配方。常用的保护剂：5%蔗糖 (乳糖 )脱脂乳保护剂；明胶蔗糖保护剂；SPGA 保护剂免疫佐剂：氢氧化铝胶(铝胶 ) ?油乳佐剂?乳化剂?白油佐剂?蜂胶佐剂?脂质体佐剂细胞因子类免疫佐剂(IL-2、 IL-4、IL-12 、IFN- ) CpG DNA(指含有非甲基化CpG(胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸)基序的脱氧核糖核酸DNA) CpG OND(含有非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸) 基因工程减毒素(霍乱毒素， CT；大肠杆菌不耐
48、热毒素，LT；破伤风类毒素，TT) 免疫刺激复合物(ISCOM ，抗原：糖苷Quil A ：胆固醇 =1:1:1) 作用机理： 抗原递呈；抗原寻的；免疫调节CpGDNA对多种免疫细胞有激活作用：引起 B 细胞分化，直接激活单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，在 IL-12 协同下激活NK 细胞，协同刺激抗原特异性B 细胞和 T细胞分化CpGODN的体内效应与应用：对天然免疫系统的刺激活性(抗感染、抗肿瘤活性)；对特异性免疫反应的调节作用疫苗佐剂(对蛋白质抗原的作用；对DNA 疫苗的作用 )；过敏性疾病治疗第六章 酶工程制药精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - -
49、 - - -第 11 页，共 21 页学习必备欢迎下载概述酶是一类具有催化活性的生物大分子，包括蛋白质和核酸一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。 酶的特点：高效性、专一性、反应条件温和、可调节性。酶的分类 ：六大类，氧化还原酶类(脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、羟化酶以及加氧酶类)、转移酶类、水解酶类 (淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶)、裂解酶类 (醛缩酶、水化酶及脱氨酶)、异构酶类 (消旋酶、顺反异构酶 )和合成酶类 (又称为连接酶) 酶的来源和生产：直接从动植物获得，即从生物体中分离和
50、提纯；化学合成方法；工业微生物发酵发酵法产酶的优点：微生物种类繁多，制备出的酶种类齐全。微生物繁殖快，生产周期短，酶的产量高，成本低。微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变以及基因工程等方法培育出新的高产酶的菌株。研究内容 ：酶的大量生产和分离纯化；新颖酶的发现、研究和应用；酶的固定化技术和固定化酶反应器；基因工程技术应用于酶制剂的生产；酶分子改造与化学修饰；有机介质中酶的反应；酶抑制剂、激活剂的开发及应用研究；抗体酶、核酸酶的研究；模拟酶、合成酶的研究；酶的定向进化研究酶的分离纯化分离纯化遵循蛋白质分离纯化的一般原则，但又有特殊性：低温：一般14条件温和：避免极端条件(剧
51、烈搅拌、 pH 、盐浓度等 ) 加入保护剂：EDTA、2-巯基乙醇等对纯化过程进行监测：不断检测酶活力和蛋白浓度 酶分离纯化的步骤：预处理初步纯化高度纯化浓缩与干燥酶的提取来源选择： 含目的多的原料。同时考虑原料的来源、取材方便经济等方面因素细胞破碎 ：机械法、物理法、化学法(有机溶剂、表面活性剂)、生物法 (酶解 ) 保护措施： 采用缓冲系统；添加保护剂；抑制水解酶的作用；其他：注意温度、搅拌、紫外光等的影响酶的抽提：目标： 将目的酶最大限度地溶解出来；保持生物活性。原则： 相似相溶；使用远离等电点的pH 值，溶解度增加。方法： 盐溶液提取 (常用 NaCl溶液 )；酸、碱溶液提取；有机溶剂
52、提取沉淀分离： 等电点沉淀；盐析；有机溶剂沉淀酶的纯化根据分子量大小分离：离心、膜分离、凝胶层析等根据电荷性质进行分离：离子交换、电泳等根据疏水作用进行分离：疏水层析、反相色谱等根据亲和作用分离：亲和层析酶和细胞的固定化游离酶的缺点：酶是蛋白质，稳定性差(热、酸碱、有机溶剂对其有影响)。酶不能回收，无法重复使用。产物中混杂酶蛋白，分离纯化困难。 固定化酶：优点 ：(1)可提高酶的稳定性。(2)酶能回收，易与产物分离，可反复使用。缺点 ：(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)酶活性下降。固定化细胞：优越性： (1) 降低成本，省去酶的分离纯化工作：(2) 既可作为单一酶，也可作为复合酶系
53、完成部分代谢过程。局限性： (1) 细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物。(2) 细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。固定化酶 (细胞 )的制备精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页，共 21 页学习必备欢迎下载 传统的酶固定化方法：载体结合法(物理吸附法、离子结合法、共价结合法)交联法 (常用戊二醛试剂)、包埋法 (网格型、微囊型) 固定化方法吸附法包埋法共价结合法交联法物理吸附法离子吸附法制备难易易易较难难较难结合程度弱中等强强强活力回收高，酶易流失高高低中等费用低低低高中等底物专一性不变不变不变可变可变酶固定化的新
54、方法：光偶联法；等离子体法；偶合固定化法；无载体固定化酶的新技术 固定化酶 (细胞 )的性质和指标固定化酶活力的改变：通常低于天然酶(有例外 ) 原因：酶的构象发生变化，影响活性中心的氨基酸；空间障碍：形成立体屏蔽；内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；包埋时，大分子底物不能透过膜固定化酶的稳定性：酶的耐热性提高，对变性剂、抑制剂、pH 值、蛋白酶以及操作条件的抵抗力增加。可能的原因： 固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形。抑制酶的自身降解。固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。固定化酶的最适温度变化：最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升(
55、有例外 ) 固定化酶的最适pH变化：带负电荷载体：最适 pH 向碱性偏移。 带正电荷载体： 最适 pH 向酸性偏移。固定化酶的表观米氏常数Km 的变化 ：固定化酶的表观Km 随载体的带电性能变化。固定化载体与酶的底物电荷相反时，固定化酶的表观Km 值降低；相同时，表观Km 值显著增加。固定化酶的作用专一性改变：与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变固定化细胞的性质：有活性升高的现象；稳定性的增加；最适温度和最适pH 常保持不变 固定化酶 (细胞 )的评价指标：活力、偶联率及相对活力、半衰期、热稳定性活力回收 =( 加入酶蛋白活力一上清液酶蛋白活力)/ 加入酶蛋白活
56、力100% 偶联率 =固定化酶总活力/( 加入酶的总活力 -上清液中未偶联酶活力)100% 偶联率 1，表明固定化对酶活性影响不明显；偶联率 1，表明固定化对降低酶活性；偶联率 1，可能有细胞分裂，或从载体中排除影响酶活性的抑制剂酶传感器： 主要由固定化酶膜和变换器组成生物传感器：酶传感器(酶电极，热敏电阻酶传感器，离子敏场效应晶体管酶传感器，光纤酶传感器)、组织传感器、微生物传感器、免疫传感器酶传感器的应用：水质监测；葡萄糖传感器和血糖测定仪；肉鲜度传感器酶反应器 ：按结构区分：搅拌罐式反应器(STR)；鼓泡式反应器(BCR )；填充床式反应器(PCR )；流化床式反应器(FBR)；膜反应器
57、 (MR) 按操作方式区分：分批式反应；连续式反应；流加分批式反应混合形式：连续搅拌罐反应器(CSTR)分批搅拌罐反应器(BSTR) 间歇式酶反应器又称为批量反应器(Batch Reactor，BSTR)、间歇式搅拌罐、搅拌式反应罐。其特点是：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶(细胞 )用过滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 13 页，共 21 页学习必备欢迎下载优点是：装置较简单，造价较低，传质阻力很小，反应能很迅速达到稳态。缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时
58、，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶连续式酶反应器又称为连续搅拌釜式反应器(Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR)、连续式搅拌罐。向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出反应液(含产物 )。优点是：在理想状况下，混合良好，各部分组成相同，并与输出成分一致。缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。填充床酶反应器填充床反应器(Packed Reactor,PBR),又称固定床反应器。将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床，然后， 通入底物溶
59、液，在一定的反应条件下实现酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液(含产物 )。优点是：高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR 是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。缺点是：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。流化床反应器流化床反应器(Fluidized Bed Reactor, FBR)。特点是： 底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。FBR 可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦可
60、用于需要供气体或排放气体的酶反应(即固、液、气三相反应)。但因 FBR 混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。膜反应器膜反应器 (membrane reactor, MR)是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。膜反应器可以制成平板型、螺旋型、 管型、 中空纤维型、 转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。反应器类型适用的操作方式适用的酶特点搅拌罐式分批式、流加分批式连续式 , 游离酶、固定化酶反应比较完全，反应条件容易调节控制
61、。填充床式连续式固定化酶密度大，可以提高酶催化反应的速度。在工业生产中普遍使用。流化床分批式、流加分批式连续式固定化酶流化床反应器具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和 pH 值的调节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反应液也可进行催化反应。鼓泡式分批式、流加分批式连续式游离酶、固定化酶鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高, 适合于有气体参与的反应。膜反应器连续式游离酶、固定化酶清洗比较困难喷射式连续式游离酶通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反应，适用于某些耐高温酶的反应 酶反应器的性能评价：固定化酶的性状；底物的物理性质；固定化酶稳定性
62、；酶反应动力学特性测定的主要参数：空时( 稀释率 ) 、空速 (空时的倒数 ) 、转化率、生产强度。酶反应器的操作：操作条件的确定；底物浓度；酶浓度；反应温度的确定与调节控制；pH值的确定与精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 14 页，共 21 页学习必备欢迎下载调控；搅拌速度；流动速度 酶反应器应用的注意事项：保持酶反应器的操作稳定性；保持反应器中流体的流动方式和状态；防止酶的失活变性；防止微生物的污染酶反应器生产能力的下降：酶本身失活；酶从载体上脱落；载体的破碎或溶解酶的化学修饰目的 ：提高酶的生物活性(酶活力 )；增强酶的稳定性(
63、热稳定性、体内半衰期)；消除抗原性(针对特异性反应降低生物识别能力)；产生新的催化能力。方法 ： 交联修饰 (交联法 )； 定点突变与化学修饰相结合；小分子修饰(酶蛋白侧链基团修饰)； 大分子修饰 (大分子结合修饰)；辅因子的引入应用 ：如： PEG超氧化物歧化酶(SOD) 、PEG溶血类蛋白质(链激酶、尿激酶等)、PEG 天门冬酰胺酶(ASNase) 消除了抗原性，延长了酶在体内的半衰期。又如：用Dextran修饰-淀粉酶，淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶提高了酶的热稳定性第七章 发酵工程制药概述 发酵的定义 ：发酵 ：(fermentation)现代发酵工业上泛指利用微生物制造或生产某些产品的
64、过程，或更确切地说，发酵是用生物催化剂(biocatalyst)使培养物质转化成产品的生物化学反应发酵工程技术：主要包括提供高性能生产菌种的菌种选育技术、实现低成本大规模生产产品的发酵技术和最终获得合格产品的分离提取技术。1897 年，毕希纳 (德国 )，酶 (enzyme) 发酵类型 ：微生物菌体发酵(苏云金杆菌是一种G+ 芽孢杆菌，在形成芽孢的过程中产生伴孢晶体)、微生物的酶、微生物的代谢产物发酵、微生物转化发酵、生物工程菌发酵 微生物发酵所生产的药物抗生素类：抗微生物、抗肿瘤、免疫调节剂等氨基酸类：精氨酸、鸟氨酸及氨基酸复方制剂等核苷酸类：肌苷酸、肌酐、辅酶A、辅酶 Q10 等维生素类：
65、麦角甾醇、维生素 B2、维生素 B12 等甾体类激素：在甾体类激素的合成过程中进行特殊的转化反应多糖类：透明质酸、右旋糖酐治疗酶及酶抑制剂：链激酶、尿激酶、淀粉酶抑制剂、克拉维酸、普伐他汀等发酵工程制药的特点菌种的选择：决定发酵的关键因素存在“生物学变量” ：理论产量难以从物料平衡中计算，存在10误差条件温和：常温常压，反应安全，条件简单必须纯种培养：发酵过程中严防污染杂菌反应专一性强：能够对复杂化合物的特定部位进行反应，得到较为单一的产物可在分子水平控制发酵：通过定向发酵、突变生物合成等生成特定结构产物投资小、见效快，经济效益显著发酵过程中的微生物常见的药用微生物：原核：细菌、放线菌(链霉素
66、菌属 )； 真核：酵母、真菌；非细胞型：噬菌体、病毒对微生物的要求精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 15 页，共 21 页学习必备欢迎下载1、遗传性状稳定，不易退化2、生长速度快，不易污染3、产量高，目标产物产量尽可能接近理论转化率4、目标产物最好分泌到胞外5、尽可能减少类似物的产量6、其所利用的培养基成分简单，价格低廉7、不是病原菌 生产菌种的选育方式：自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因重组自然选育 (natural screening)：自发突变定向培育 (directive breeding)：筛选抗性菌株诱变育种
67、 (mutation breeding)：营养缺陷型菌株机制 ：微小损伤突变(碱基置换 、码组移动突变)；染色体畸变 (易位、倒位、缺失、重复)；染色体组突变诱变方法： 物理诱变：紫外线、X 射线、射线、中子等；化学诱变：氮芥、亚硝基胍、亚硝酸、5-Fu 等；生物诱变“噬菌体杂交育种 ：比诱变育种具有更强的方向性和目的性原生质融合 ：又称细胞融合基因工程育种：预先设计和控制菌种保藏1、斜面低温法 ：4， 1-6m 。简便易行，成活率高；保藏期短，传代次数多，易变异和污染2、石蜡油封存法：4、阻氧、灭菌，1-2y ，适用各大类菌种，不适于分解烃类菌种。3、沙土管保藏法：4、无氧、干燥、低温和无营
68、养条件保藏，1-10y 。较适用于产孢子以及形成芽孢的微生物4、麸皮保藏法 ：又称曲法保藏，低温干燥，1y ，适于产孢子的霉菌及放线菌，工厂采用较多。5、甘油悬液保藏法：甘油终浓度为10%-15% ，-20 -1y ；-70 -10y 。常用于保藏基因工程菌。6、冷冻真空干燥保藏法：5-15y ，适于各类微生物7、液氮超低温保藏法： -196 ， 15y ，适于各类微生物8、宿主保藏法 ：被感染的宿主一同低温保藏。适于专性活细胞寄生微生物(病毒、立克次体)。发酵设备及消毒灭菌 发酵设备：种子制备设备(种子罐 )、主发酵设备(发酵罐 )、辅助设备 (制备无菌空气和培养基)、发酵液预处理设备、粗产
69、品提取设备、产品精制干燥设备、流出物回收利用及处理设备 发酵罐的基本类型要求：结构严密、良好的液体混合功能、高的传质和传热率、灵敏可靠的检测和控制仪表类型 ：用不同的手段使发酵罐内的气、固、液三相充分混合，从而满足微生物生长和产物形成对氧的需求搅拌釜反应器优点：传质速率、混合速率、气体运输率较高；操作灵活；适用性广泛缺点：搅拌功率消耗大；因罐内结构复杂，不易清洗干净，易被杂菌污染；培养丝状菌时，常因搅拌桨叶的剪切力致使菌丝易被切断，细胞易受损伤主要部件：罐体、搅拌器(叶式、弯叶式、箭叶式)、挡板、冷却装置、轴封、消泡器等鼓泡式反应器：通过液体中空气上升的动力带动液体，进行混合气升式反应器：通过
70、液体中空气上升的动力，带动液体形成环流，进行混合发酵辅助设备：无菌空气系统、灭菌系统 、发酵车间的管道和阀门等好气性培养对空气的要求：无菌、无尘、无杂质、正压培养基的成分：碳源 (速效、迟效 )、氮源 (有机、无机 )、无机盐及微量元素、生长因子、前体、促进剂、抑制剂等精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 16 页，共 21 页学习必备欢迎下载培养基的类型：孢子培养基、种子培养基、发酵培养基培养基的灭菌：高压蒸汽湿热灭菌(常用 121 138 ， 30 min 50min ) 空罐、实灌、连续灭菌发酵工程制药的过程与控制 发酵工程的基本过
71、程：上游工程：菌种选育、中试；发酵生产：中心环节；下游工程：产物分离纯化鉴定、副产物回收、废物处理种子的扩大培养种子要求： 生长活力强、生理状态稳定、菌体总量及浓度能满足下一步发酵要求、无杂菌、能保持稳定的生产能力发酵级数： 指制备种子需逐级扩大培养的次数。级数越大，越易染菌和变异，管理越困难；一般控制在 2-4 级种龄： 指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常到对数期生长，菌体量未达最高峰时。种龄过短则菌体太少，过长则菌体易老化。接种量： 种子液体积与接种后发酵罐培养液总体积之比。5%-15% 发酵方式 ：分批发酵、补料-分批发酵、半连续发酵、连续发酵(与动物细胞
72、工程相比)分批发酵 ：是将发酵培养基组分一次性投入发酵罐，经灭菌、接种和发酵后，再一次性加工发酵液放出，是在一封闭培养系统内具有初始限制量基质的一种发酵方式。常采用单罐深层培养法。细菌的生长周期：延滞期、对数生长期、稳定期、衰亡期特点：操作简单，周期短，不易染菌，生产过程和产品质量容易掌握；由于生产过程中养分容易耗尽，积累有害产物，不适合于对基质浓度敏感的产物或次级代谢产物。补料 -分批发酵 ：发酵过程中间歇或连续补加新鲜料液，以克服由于养份不足，发酵提前终止的问题。不是封闭体系；培养液“只进不出”；适用于培养液某营养组份明显影响产量时半连续培养 ：发酵过程中间歇或连续补加新鲜料液；间歇放掉部
73、分培养液进入下游工艺；既补充养料，又稀释有害物质。缺陷：损失菌体和营养物质；造成发酵液稀释，不利于下游工艺；造成前体丢失，影响产量；染杂菌连续培养 ：在发酵过程中某一时段，一边连续补充培养液，一边以相同流速放出发酵液，维持原有发酵体积。有利于维持微生物生长环境的稳定。优点：使产率和产品质量保持稳定；反应器容积小，容易对发酵过程进行控制；更易实现机械化和自动化控制；减少非生产占用时间缺点：易染菌；微生物容易发生变异；对仪器设备要求高；对粘性丝状菌效果不好；对营养物的利用低于单批发酵，一般只能维持数月至一年 发酵过程中的中间分析项目：产物产量；pH 值；糖(间接推测产物生物合成效率)；氨基酸；菌丝
74、形态产物产量 ：通过监测产物产量判断发酵结果，化学测定法。PH 值：代谢产物影响培养液pH 值，通过培养基中的组分维持合适的pH 值，或通过人工方法进行调节糖：糖的消耗反应菌体代谢活力的变化。通过糖量测定，间接推测产物生物合成效率。氨基氮 ：通过测定游离氨基酸的数值，侧面反应微生物含氮物质的代谢，推测发酵情况。菌丝形态： 通过检测菌丝形态，监测微生物生长状态，及时调整发酵策略。 发酵过程的影响及控制：菌体浓度 (600nm 处 OD值) 、营养物质、温度、pH值、溶氧、泡沫、染菌菌体浓度 通过控制培养液中营养基质的浓度(基础培养基各成分要有适当配比；通过中间补料调整培养基成分) 营养物质 ：碳
75、源、氮源用含有两种碳/ 氮源的培养基进行控制；磷酸盐对初级代谢产物及次级代谢产物的控制；补料的控制温度在发酵不同阶段，采用不同温度；针对不同条件，采用不同温度精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 17 页，共 21 页学习必备欢迎下载pH 值调节培养基组分，增加缓冲体系；补料；补加酸碱溶氧调节搅拌转速和通气率；控制菌体浓度，使细菌比生长速率略高于临界值CO2控制通气量；控制搅拌速度；控制补料工艺泡沫机械消沫；消泡剂消沫染菌设备无渗漏；管道系统无渗漏；空气净化系统正常发酵终点的确定指标：生产率、得率和发酵系数。原则：上述指标高，成本低生产率
76、 kg 产物 / 发酵液体积 (L)h ；得率 =kg 产物 /kg基质；发酵系数=kg 产物 / 罐容积 m3h 基因工程菌的发酵特点： 基因工程菌培养过程中具有不稳定性。常分为两阶段发酵- 菌体生长阶段(高密度发酵)；表达外源产物阶段。基因工程菌的不稳定性?质粒不稳定 ：分离不稳定(产生一定比例不含质粒的子代菌)；结构不稳定 (DNA重排或缺失致使工程菌性能改变 ) ?产物不稳定 ：被宿主细胞的降解、产物变性等基因工程菌的发酵控制：培养基分批补料；溶氧增加搅拌速度和通气量；温度前高后低；pH及时控制产生的大量乳酸和CO2 发酵罐的要求发酵工程中的代谢调控和代谢工程初级代谢和次级代谢的主要区
77、别初级代谢过程自始至终都存在于一切生活细胞之中,并与机体的生长过程呈平行关系;而次级代谢则仅在机体生长的某一个时期产生,与微生物的生长不呈平行关系。初级代谢产物在不同的微生物中基本相同,而次级代谢产物的种类在不同微生物中是非常不同的。初级代谢对环境变化的敏感性比较小,即遗传稳定性强，而次级代谢对环境条件的变化很敏感, 其产物的合成往往会因环境条件的变化而停止。催化初级代谢产物合成的酶专一性强，而催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强。代谢产物合成的调控改变微生物代谢调节的方式?控制微生物发酵条件：使用诱导物、改变细胞通透性、添加生物合成前体、解除末端产物反馈调节、解除分解代谢物阻遏(解除分解代
78、谢物阻遏的方法：葡萄糖效应- 控制发酵的培养基成分和浓度)?诱变育种：营养缺陷型突变株、抗反馈突变株、抗阻遏突变株、抗生素突变株与末端代谢产物结构类似的化合物会干扰正常菌体的代谢, 甚至引起菌体死亡定向发酵：突变生物合成、杂合成物合成、外源微生物药物的转化代谢工程：改变代谢流、扩展代谢途径、转移或构建新的代谢途径发酵工程制药的实例：抗生素、氨基酸、多糖、维生素补充：利用生物工程生产啤酒、味精、胰岛素、酸奶的常用菌种分别是酵母菌、枯草杆菌、大肠杆菌、乳酸菌细胞膜透性的改变，可解除代谢产物对酶活性的抑制微生物在生长代谢过程中分泌的代谢产物有初级代谢产物、次级代谢产物前者是微生物所产生的产物，如氨基
79、酸、核酸、类脂糖类。后者是在微生物生长到一定时期，以初级代谢产物为前提物质而合成对微生物生命活动无明确功能性质的过程中所产生的产物。如抗生素、生物碱、植物生长因子等。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 18 页，共 21 页学习必备欢迎下载第八章微生物转化微生物转化 ，microbial transformation就是利用微生物的一种或几种酶的专一催化功能，对某个有机化合物的分子结构的特定位置，实现一种或几种化学反应，使其转化成结构相似的更有价值的新化合物。应用：有机化合物的合成、药物前体化合物的转化、活性成分筛选、新药的看法、药物代
80、谢模型预测类型及实例氧化反应：生产葡萄糖酸；将氨基氧化为硝基(氯霉素的转化) 还原反应：还原醛到醇(组胺醛 ) 水解反应：酯的水解、苷的水解、硫醚开裂缩合反应：制备麻黄碱中间体1-苯基 -1-羟基丙酮其他反应：胺化反应(间型霉素B 的转化 )、脱羧反应、酰基化反应、脱水反应微生物转化反应的特点可以用静止细胞进行，也可以用发酵方式进行转化以及应用固定化细胞进行生产等。它跟酶法转化和有机化学转化比较有以下特点：反应条件温和、公害少、设备简单且反应速度快可以减少反应步骤对立体结构具有高度的专一选择性回收率高、成本低甾体微生物转化反应类型：羟化 (C9 羟化，一个关键中间步骤；C11 羟化是微生物特有
81、的反应，菌株以黑霉素最好)；环氧化 (新月弯孢霉或布氏小克银汉菌，9，11环氧化合物 )；脱氢 (A 环的 C1,2和 C4,5位之间， B 环 C5,6之间 )；芳香化 (A 环)；羟基转化为酮基(C3、C3)；酮基还原为羟基(C3、C17、C20)；边链降解 (始于 C17位羟化，经氧化，生成C17酮化合物 ) 例：可的松的生产：化学合成法：难以在11 位导入氧原子。Sarret ：用 576kg 脱氧酸， 2 年， 30 余步反应，得到938mg醋酸可的松Petterson和 Murry ：1952 年，黄体酮，用霉菌进行11羟化，再经 10 步化学法得到可的松两个阶段 ：生长阶段、转化
82、阶段生物技术控制途径：通过甾醇结构的修饰；在微生物降解过程中加酶抑制剂(9 羟化酶和 C1,2 脱氢酶 )；通过诱变技术或利用基因工程技术改造菌种，造成相关酶的缺损，使得微生物只能选择性降解边链，而不降解母核。甙类物质的生物转化萜类分子的生物转化组合生物合成(Combinatorial Biosynthesis) 几种天然药物的微生物转化：雷公藤内酯 (雷公藤甲素 (短刺小克银汉酶)；雷公藤内酯酮(黑曲霉 )；鬼臼毒素；大黄蒽醌类；麻黄碱第九章蛋白质药物的化学修饰 第一个蛋白质类抗体1891 年，德 Behring发现白喉外毒素免疫动物产生的抗血清能治疗白喉患者 第一个重组蛋白质药物1982
83、年，美国Eli Lilly 公司重组人胰岛素 Humulin(优泌林 )上市蛋白质药物分类精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 19 页，共 21 页学习必备欢迎下载替代缺乏或异常蛋白质药物：蛋白质激素(胰岛素、生长激素、促性腺激素)；血浆蛋白类(血浆白蛋白、丙种球蛋白及促红细胞生成素、凝血因子) 增强蛋白质生物活性通路药物：细胞生长调节因子(IFN、IL) 提供新功能或新活性：胶原蛋白 (明胶、冻干猪皮) 直接干扰靶分子或靶组织：各种受体分子、抗体及单克隆抗体；蛋白酶抑制剂(胰蛋白酶抑制剂)；碱性蛋白质 (硫酸鱼精蛋白) 优点(高活性；
84、特异性强；较低毒性；生物功能明确缺点：抗原 -抗体反应强 (免疫原性强 )；血浆半衰期短，迅速被体内酶降解；易被肾小球过滤清除；溶解度及稳定性差，导致沉淀蛋白质药物化学修饰 第一个化学修饰蛋白质药物PEG 修饰的腺苷脱氨酶(PEG-ADA)，用于小儿先天ADA 缺乏症 应用：纯度鉴定与分析；结构与作用机制研究；固定化(不溶于水 )；改性 蛋白质药物化学修饰意义?循环半衰期延长?增大分子量，避免肾小球滤过?免疫原性降低或消失，毒副作用减少?物理、化学和生物稳定性增强?增加药物溶解度，延长体内水解时间修饰剂 (Modifier) 选取的一般原则：1.修饰剂毒性、抗原性、稳定性；2.修饰剂反应活性及
85、对修饰位点的选择性；3.修饰剂与蛋白质连接键的稳定性；4.修饰剂对蛋白构象及生物活性的影响；5.是否适于建立快速、方便的分析、分离纯化方法；6.修饰剂是否价廉易得 主要类型 ：水溶性高分子聚合物：常用聚乙二醇 (PEG) ；小分子修饰剂。修饰剂需活化 修饰策略随机修饰 (random modification)氨基 (游离赖氨酸残基-NH2) 定点修饰 (site specific modification)针对特定基团或专一位点进行修饰，有利于保持蛋白质药物活性，质量易控。氨基修饰(N-末端-NH2)；巯基修饰 (-SH 高亲和性 )；羧基修饰 (-COOH) 聚乙二醇化修饰PEG 优势：?
86、 无毒性、两亲性、无抗原性、强生物相容性? 为避免在修饰过程中发生交联和团聚，常采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG) 衍生物作为修饰剂选择 PEG 需考虑因素? PEG 的 Mr：Mr 越大，蛋白活性、免疫原性越低，稳定性越高、半衰期越长? 选择非活性部位氨基酸残基作为修饰位点：定点修饰优于随机修饰? 水解稳定性及反应活性：pH 控制经 PEG 修饰的蛋白质? 稳定性提高? 在人体的保留时间延长，肾小球滤过减少? 免疫原性降低，减少抗体产生? 蛋白溶解度增加? 被 PEG 掩盖后，酶解机会减少，药物半衰期延长，注射次数减少，使蛋白类药物变成长效制剂随机修饰1.经活化后方可用；2.修饰靶点多为游离赖
87、氨酸残基-NH2和 N 末端的-NH2；3.同分异构体数量多，质量难控，选择性不高等精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 20 页，共 21 页学习必备欢迎下载溴化氰活化法；羰基二咪唑活化法缺点：本身免疫原性、无特异性、毒性中间体、对活性影响大等定点修饰氨基修饰 ：N 末端-NH2(烷基化修饰 )；定点突变去除赖氨酸-NH2；保护剂定点保护与脱保护；氧化去氨基巯基修饰：修饰专一性高于氨基修饰包埋与蛋白质内部的-SH(如对-IFN 的修饰 )； 基因工程技术引入-SH； 二硫键定点修饰羧基修饰修饰位点 (天冬氨酸、谷氨酸及C 末端羧基 )；
88、在碳二亚胺存在下，将PEG 中的氨基与蛋白质的羧基结合；但同时也易产生其它的交联反应糖基化修饰 ：右旋糖酐、肝素类、甘露聚糖、硫酸软骨素、壳聚糖、环糊精；多为随机修饰，需要活化人血清白蛋白修饰：戊二醛法；碳二亚胺法；活性酯法其他修饰剂 ：脂肪酸；糖肽；卵磷脂目前已上市的PEG 修饰的蛋白质 ：腺苷脱氨酶 (重症免疫缺陷 )、天冬酰胺酶 (急性淋巴细胞白血病)、干扰素(丙型肝炎、 肿瘤、多发性硬化症、 艾滋病 )、粒细胞集落刺激因子(肿瘤化疗引起的中性粒细胞减少)、生长激素受体拮抗剂(肢端肥大症 )、抗血管内皮生长因子适配体(黄斑变性 )、促红细胞生成素(胃性贫血)、抗肿瘤坏死因子(类风湿关节炎、回肠炎)、尿酸酶 (痛风 ) 化学修饰的超氧化物歧化酶SOD ?氧自由基清除剂，避免机体内过高超氧阴离子自由基浓度导致损伤?不具有免疫原性的水溶性高分子修饰剂(右旋糖酐、糖肽、药用淀粉、肝素、透明质酸等) 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 21 页，共 21 页
