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1、绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白将色彩引入生命科学研究将色彩引入生命科学研究GFPBring the Colors to the Study for Life Science南京师范大学生命科学学院南京师范大学生命科学学院南京师范大学生命科学学院南京师范大学生命科学学院张朝张朝张朝张朝2011.11.9绿色荧光蛋白的分子生物学绿色荧光蛋白的分子生物学及其应用及其应用The Nobel Prize in Chemistry 2008n nfor the discovery and development of the green fluorescent protein, GFPOsamu Shimomu
2、ra Martin Chalfie Roger Y. Tsien Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, USA; Boston University Medical School Massachusetts, MA, USA Columbia University New York, NY, USA University of California San Diego, CA, USA; Howard Hughes Medical Institute 2008年诺贝尔化学奖获得者及其贡献年诺贝尔化学奖获得者及其贡献下下村村修修，日日本本人人
3、，名名古古屋屋大大学学理理学学博博士士毕毕业业后后赴赴美美，先先后后在在美美国国普普林林斯斯顿顿大大学学、波波士士顿顿大大学学和和伍伍兹兹霍霍尔尔海海洋洋生生物物实实验验所所工工作作。1962年年从从一一种种水水母母中中发发现现了了荧荧光光蛋蛋白白，被被誉誉为为生生物物发发光光研研究究第第一一人人。 钱钱永永健健，美美籍籍华华裔裔，现现为为美美国国加加州州大大学学圣圣迭迭戈戈分分校校生生物物化化学学及及化化学学系系教教授授、美美国国国国家家科科学学院院院院士士、国国家家医医学学院院院院士士，2004年年沃沃尔尔夫夫医医学学奖奖得得主主。其其主主要要贡贡献献在在于于利利用用水水母母发发出出绿绿光
4、光的的化化学学物物来来追追查查实实验验室室内内进进行行的的生生物物反反应应，他他被被认认为为是是这这方方面面公公认认的的先先驱驱。 马马丁丁沙沙尔尔菲菲，美美国国哥哥伦伦比比亚亚大大学学生生物物学学教教授授，他他获获奖奖的的主主要要贡贡献献在在于于向向人人们们展展示示了了绿绿色色荧荧光光蛋蛋白白作作为为发发光光的的遗遗传传标标签签的的作作用用，这这一一技技术术被被广广泛泛运运用用于于生生理理学学和和医医学学等等领领域域。 n n19621962年年年年ShimomureShimomure等首先从维多利亚水母等首先从维多利亚水母等首先从维多利亚水母等首先从维多利亚水母( (Aequorea Vi
5、ctoriaAequorea Victoria) )中分离出了中分离出了中分离出了中分离出了GFP (Green-Fluorescent Protein) GFP (Green-Fluorescent Protein) 。 绿色荧光蛋白的研究史绿色荧光蛋白的研究史 维多利亚水母维多利亚水母维多利亚水母维多利亚水母(Aequorea Victoria)(Aequorea Victoria) A test tube containing a sample of a cyan (greenish-blue) fluorescent protein from a sea anemone illumin
6、ated by ultra-violet light from below. n n水母体内有一种发光蛋白Aequorin，它与钙离子结合时会发出蓝光，这道蓝光立刻被一种蛋白吸收，从而发出绿色萤光。n n这种捕获蓝光、发出绿光的蛋白质，就是GFP水母发光蛋白发出的蓝光通过能量转移激发GFP发出绿光1.水母发光蛋白脱辅水母发光蛋白+氧化荧光素+蓝光绿色荧光蛋白 绿光水母素在钙离子的刺激下发光，其能量可转移到GFP上，刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移（FRET）在生物中的发现。钙离子蓝光发光过程下村修n n下村修因此成为首位从水母中分离出GFP，并发现这种蛋白质在紫外光下呈亮绿
7、色的科学家，他被誉为生物发光研究的第一人n n19921992年年年年PrasherPrasher等克隆了等克隆了等克隆了等克隆了GFPGFP基因的基因的基因的基因的cDNAcDNA，并分析了，并分析了，并分析了，并分析了GFPGFP的一级结构。的一级结构。的一级结构。的一级结构。 绿色荧光蛋白的研究史绿色荧光蛋白的研究史马丁沙尔菲n n如果说下村修是绿色荧光如果说下村修是绿色荧光蛋白的蛋白的“接生婆接生婆”，沙尔，沙尔菲则是绿色荧光蛋白的价菲则是绿色荧光蛋白的价值发现者。值发现者。 n n马丁马丁沙尔菲等对实现沙尔菲等对实现GFPGFP的基因表达做出了突的基因表达做出了突出的贡献出的贡献n
8、n他获奖的主要贡献在于向他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作作为发光的遗传标签的作用。用。 绿色荧光蛋白的研究史绿色荧光蛋白的研究史n n19941994年年年年ChalfieChalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFPGFP，开创了，开创了，开创了，开创了GFPGFP应用研究的先河。应用研究的先河。应用研究的先河。应用研究的先河。钱永健n n钱永健在改造GFP方面取得了卓越的成就。1995年，他完成的单点突变（S65T）显著提高了
9、GFP的光谱性质，起荧光强度和光稳定性也大大增强。n n钱永健的主要贡献在于利用GFP来追踪追踪多种生物细胞进行的生物反应，他是这方面公认的先驱。n n之后很快发现之后很快发现之后很快发现之后很快发现GFPGFPGFPGFP能在多种异源细胞中表达，能在多种异源细胞中表达，能在多种异源细胞中表达，能在多种异源细胞中表达，GFPGFPGFPGFP在细胞学、在细胞学、在细胞学、在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮。分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮。分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮。分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮。 199
10、7199719971997年年年年10101010月月月月18-2218-2218-2218-22日在美国日在美国日在美国日在美国New-JerseyNew-JerseyNew-JerseyNew-Jersey专门召开了一次关于专门召开了一次关于专门召开了一次关于专门召开了一次关于GFPGFPGFPGFP的国际会议。的国际会议。的国际会议。的国际会议。 绿色荧光蛋白的研究史绿色荧光蛋白的研究史n20072007年年1 1月月7 7日，东北农业大学刘忠华教授主持的转基因克日，东北农业大学刘忠华教授主持的转基因克隆猪课题获得成功。中国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪隆猪课题获得成功。中国首例绿色荧光蛋
11、白转基因克隆猪成功产下成功产下2 2头具有绿色荧光遗传特征的小猪。这是继美国、头具有绿色荧光遗传特征的小猪。这是继美国、韩国、日本之后第四例成功通过体细胞核移植方式生出的韩国、日本之后第四例成功通过体细胞核移植方式生出的绿色荧光蛋白转基因克隆猪。绿色荧光蛋白转基因克隆猪。 绿色荧光蛋白的研究史绿色荧光蛋白的研究史绿色荧光蛋白的结构解析绿色荧光蛋白的结构解析绿色荧光蛋白的结构解析绿色荧光蛋白的结构解析维多利亚水母维多利亚水母维多利亚水母维多利亚水母 GFPGFP的的的的cDNAcDNA编码区全长编码区全长编码区全长编码区全长717nt717nt绿色荧光蛋白的结构解析绿色荧光蛋白的结构解析维多利亚
12、水母维多利亚水母维多利亚水母维多利亚水母 GFPGFP由由由由 238 aa238 aa组成，分子量约组成，分子量约组成，分子量约组成，分子量约 27 kD 27 kD 绿色荧光蛋白的结构解析绿色荧光蛋白的结构解析 GFP GFP 晶体结构显示晶体结构显示晶体结构显示晶体结构显示 , , 蛋白蛋白蛋白蛋白质中央是一个罐形结构质中央是一个罐形结构质中央是一个罐形结构质中央是一个罐形结构 , , 长长长长 420 nm , 420 nm , 宽宽宽宽 240 nm , 240 nm , 由由由由 11 11 个围绕中心个围绕中心个围绕中心个围绕中心 螺旋的反平行螺旋的反平行螺旋的反平行螺旋的反平行
13、 折叠组成折叠组成折叠组成折叠组成 , , 荧光基团的形成荧光基团的形成荧光基团的形成荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的就是从这个螺旋开始的就是从这个螺旋开始的就是从这个螺旋开始的 , , 罐的罐的罐的罐的顶部由顶部由顶部由顶部由 3 3 个短的垂直片段覆盖个短的垂直片段覆盖个短的垂直片段覆盖个短的垂直片段覆盖 , , 底部由一个短的垂直片段覆底部由一个短的垂直片段覆底部由一个短的垂直片段覆底部由一个短的垂直片段覆盖盖盖盖 , , 对荧光活性很重要的生色对荧光活性很重要的生色对荧光活性很重要的生色对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。团则位于大空腔内。团则位于大空腔内。团则位于大空腔内。绿色
14、荧光蛋白的结构解析绿色荧光蛋白的结构解析 A topology diagram of the folding pattern in GFP. The -sheet strands are shown in light green, a-helices in blue, and connecting loops in yellow. The positions in the sequence that begin and end each major secondary structure element are also given. The anti-parallel strands (ex
15、cept for the interactions between strands 1 and 6) make a tightly formed barrel. The green fluorescent protein GFP consists of 238 amino acids, linked together in a long chain. This chain folds up into the shape of a beer can. Inside the beer can structure the amino acids 65, 66 and 67 form the chem
16、ical group that absorbs UV and blue light, and fluoresces green. 绿色荧光蛋白的罐形结构绿色荧光蛋白的罐形结构绿色荧光蛋白的罐形结构绿色荧光蛋白的罐形结构绿色荧光蛋白的结构解析绿色荧光蛋白的结构解析 The dimer contact region. The dimer contact region. The two polypeptide chains The two polypeptide chains associate over a broad area, with associate over a broad area,
17、 with a small hydrophobic patch (in a small hydrophobic patch (in the yellow box) and numerous the yellow box) and numerous hydrophilic contacts. The two-hydrophilic contacts. The two-fold symmetry axis is in the plane fold symmetry axis is in the plane of the page, and is marked by the of the page,
18、 and is marked by the red arrow. The polar residues are red arrow. The polar residues are marked with red atoms for marked with red atoms for oxygen and blue for nitrogen. oxygen and blue for nitrogen. 绿色荧光蛋白的结构解析绿色荧光蛋白的结构解析绿色荧光蛋白的发光特性绿色荧光蛋白的发光特性 GFP GFP GFP GFP吸收的光谱吸收的光谱吸收的光谱吸收的光谱, , , ,最最最最大峰值为大峰值
19、为大峰值为大峰值为395nm(395nm(395nm(395nm(紫外紫外紫外紫外),),),),并有一个峰值为并有一个峰值为并有一个峰值为并有一个峰值为470nm470nm470nm470nm的的的的副峰副峰副峰副峰( ( ( (蓝光蓝光蓝光蓝光););););发射光谱最发射光谱最发射光谱最发射光谱最大峰值为大峰值为大峰值为大峰值为509nm(509nm(509nm(509nm(绿光绿光绿光绿光),),),),并带有峰值为并带有峰值为并带有峰值为并带有峰值为540nm540nm540nm540nm的侧的侧的侧的侧峰峰峰峰(Shouder)(Shouder)(Shouder)(Shouder)
20、。绿色荧光蛋白的发光特性绿色荧光蛋白的发光特性n nGFPGFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)(FITC)很相似，因此为荧很相似，因此为荧很相似，因此为荧很相似，因此为荧光素光素光素光素FITCFITC设计的荧光显微镜滤光片组合也适用设计的荧光显微镜滤光片组合也适用设计的荧光显微镜滤光片组合也适用设计的荧光显微镜滤光片组合也适用GFPGFP观察。观察。观察。观察。n n尽管尽管尽管尽管450450490nm(490nm(蓝光蓝光蓝光蓝光) )是是是是GFPGFP的副吸收峰，但由于长波能量低，的副吸收峰
21、，但由于长波能量低，的副吸收峰，但由于长波能量低，的副吸收峰，但由于长波能量低，细胞忍受能力强细胞忍受能力强细胞忍受能力强细胞忍受能力强, ,因此更适合于活体检测。因此更适合于活体检测。因此更适合于活体检测。因此更适合于活体检测。n nGFPGFP荧光极其稳定，在激发光照射下，荧光极其稳定，在激发光照射下，荧光极其稳定，在激发光照射下，荧光极其稳定，在激发光照射下，GFPGFP抗光漂白抗光漂白抗光漂白抗光漂白(Photobleaching)(Photobleaching)能力比荧光素能力比荧光素能力比荧光素能力比荧光素(fluorescein)(fluorescein)强，特别在强，特别在强，
22、特别在强，特别在450450490nm490nm蓝光波长下更稳定。蓝光波长下更稳定。蓝光波长下更稳定。蓝光波长下更稳定。n nGFPGFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFPGFP转变为转变为转变为转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFPGFP荧光便荧光便荧光便荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影
23、响立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFPGFP荧光。中度氧荧光。中度氧荧光。中度氧荧光。中度氧化剂对化剂对化剂对化剂对GFPGFP荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。二酸或甲醛等。二酸或甲醛等。二酸或甲醛等。 但但但但GFPGFP对某些封片指甲油特别敏感。对某些封片指甲油特别敏感。对某些封片指甲油特别敏感。对某些封片指甲油特别敏感。n nGFPGFP荧光在荧光在荧光在荧光在pH7.0-12.0pH7.0-12.
24、0稳定，在稳定，在稳定，在稳定，在pH5.5-7.0pH5.5-7.0开始受到影响，高开始受到影响，高开始受到影响，高开始受到影响，高温温温温(70)(70)、极端、极端、极端、极端pHpH或胍基氯化物条件下，或胍基氯化物条件下，或胍基氯化物条件下，或胍基氯化物条件下，GFPGFP会变性，荧会变性，荧会变性，荧会变性，荧光消失，一旦外界条件恢复正常，荧光将部分恢复。光消失，一旦外界条件恢复正常，荧光将部分恢复。光消失，一旦外界条件恢复正常，荧光将部分恢复。光消失，一旦外界条件恢复正常，荧光将部分恢复。绿色荧光蛋白的发光特性绿色荧光蛋白的发光特性 GFP GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一
25、个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收
26、一个光子，激活的水分子通常就影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保护。发色团（右图）由蛋白质
27、链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或丝氨酸）护。发色团（右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或丝氨酸）护。发色团（右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或丝氨酸）护。发色团（右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或丝氨酸）自发形成。自发形成。自发形成。自发形成。绿色荧光蛋白的发光基团绿色荧光蛋白的发光基团 GFP GFP 荧光的产生主要归功于分子内第荧光的产生主要归功于分子内第荧光的产生主要归功于分子内第荧光的产生主要归功于分子内第 6565、66 66 、67 67 位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。位丝氨酸、酪氨酸、甘
28、氨酸形成生色团的功效。位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。GFPGFP荧光生色团荧光生色团荧光生色团荧光生色团 翻译出的蛋白质折叠环化之后翻译出的蛋白质折叠环化之后翻译出的蛋白质折叠环化之后翻译出的蛋白质折叠环化之后 , , 在在在在 OO2 2 存在下存在下存在下存在下 ，分子内，分子内，分子内，分子内 Gly 67Gly 67的酰胺对第的酰胺对第的酰胺对第的酰胺对第 Ser 65Ser 65的羧基的亲核攻击形成第的羧基的亲核攻击形成第的羧基的亲核攻击形成第的羧基的亲核攻击形成第 5 5 位碳原子咪唑基位碳原子咪唑基位碳原子咪唑基位碳原子咪唑基
29、 , Tyr 66, Tyr 66的的的的22键脱氢反应键脱氢反应键脱氢反应键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合。这样之后，导致芳香团与咪唑基结合。这样之后，导致芳香团与咪唑基结合。这样之后，导致芳香团与咪唑基结合。这样 , GFP , GFP 分子中形成对羟基苯甲酸咪唑分子中形成对羟基苯甲酸咪唑分子中形成对羟基苯甲酸咪唑分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团环酮生色团环酮生色团环酮生色团 , , 该过程可以自动催化完成。该过程可以自动催化完成。该过程可以自动催化完成。该过程可以自动催化完成。绿色荧光蛋白的发光基团绿色荧光蛋白的发光基团 Stereo view of the fluoropho
30、re and its environment. His148, Gln94 and Stereo view of the fluorophore and its environment. His148, Gln94 and Arg96 can be seen on opposite ends of the fluorophore and probably stabilize Arg96 can be seen on opposite ends of the fluorophore and probably stabilize resonant forms of the fluorophore.
31、 Charged, polar, and non-polar side chains resonant forms of the fluorophore. Charged, polar, and non-polar side chains all contact the fluorophore in some way.all contact the fluorophore in some way.绿色荧光蛋白的发光基团绿色荧光蛋白的发光基团His48Gln94Arg96 Model of the fluorophore and its environment superposed on the
32、 MAD-phased electron density map at 2.2 resolution. The clear definition throughout the map allowed the chain to be traced and side chains to be well placed. The density for Ser65, Tyr66 and Gly67 is quite consistent with the dehydrotyrosine - imidazolidone structure proposed for the fluorophore. Ma
33、ny of the side chains adjacent to the fluorophore are labeled. 绿色荧光蛋白的发光基团绿色荧光蛋白的发光基团 目前对目前对目前对目前对GFPGFP的荧光发光机制还不清楚，的荧光发光机制还不清楚，的荧光发光机制还不清楚，的荧光发光机制还不清楚，MoriseMorise等人曾提出一个能量传递模等人曾提出一个能量传递模等人曾提出一个能量传递模等人曾提出一个能量传递模式图来解释水母的发光机制，但并未获得认同。式图来解释水母的发光机制，但并未获得认同。式图来解释水母的发光机制，但并未获得认同。式图来解释水母的发光机制，但并未获得认同。Chat
34、toajChattoaj等对等对等对等对GFPGFP进行了光谱分进行了光谱分进行了光谱分进行了光谱分析，结合前人工作提出，析，结合前人工作提出，析，结合前人工作提出，析，结合前人工作提出，GFPGFP有两个明显的吸收带，对应于有两个明显的吸收带，对应于有两个明显的吸收带，对应于有两个明显的吸收带，对应于GFPGFP的两种不同构象的两种不同构象的两种不同构象的两种不同构象的基态的基态的基态的基态A A和和和和B B。基态。基态。基态。基态A A对应于对应于对应于对应于395nm395nm的吸收峰，基态的吸收峰，基态的吸收峰，基态的吸收峰，基态 B B对应于对应于对应于对应于475nm475nm的
35、吸收峰，基的吸收峰，基的吸收峰，基的吸收峰，基态态态态A A占优势，基态占优势，基态占优势，基态占优势，基态B B的分子数量约是基态的分子数量约是基态的分子数量约是基态的分子数量约是基态A A的的的的1/61/6，两种基态间能缓慢地转换，但，两种基态间能缓慢地转换，但，两种基态间能缓慢地转换，但，两种基态间能缓慢地转换，但激发态激发态激发态激发态(*)(*)之间的转换很快且发生了质子转移，之间的转换很快且发生了质子转移，之间的转换很快且发生了质子转移，之间的转换很快且发生了质子转移，A*A*快速高效地衰变至另一激发态，快速高效地衰变至另一激发态，快速高效地衰变至另一激发态，快速高效地衰变至另一
36、激发态，应该存在一个中间过度态应该存在一个中间过度态应该存在一个中间过度态应该存在一个中间过度态I I，质子转移使，质子转移使，质子转移使，质子转移使A*A*转变成转变成转变成转变成I*, I*I*, I*回迁到基态回迁到基态回迁到基态回迁到基态I I时产生发射时产生发射时产生发射时产生发射峰峰峰峰504nm504nm的荧光，构象改变使的荧光，构象改变使的荧光，构象改变使的荧光，构象改变使I*I*转变成转变成转变成转变成B*B*，由，由，由，由B*B*到到到到B B发射荧光而不发生质子转移。发射荧光而不发生质子转移。发射荧光而不发生质子转移。发射荧光而不发生质子转移。目前，对于目前，对于目前，
37、对于目前，对于GFPGFP的作用机理较为认同的仅仅是：的作用机理较为认同的仅仅是：的作用机理较为认同的仅仅是：的作用机理较为认同的仅仅是：GFPGFP是生物发光过程中的能量受是生物发光过程中的能量受是生物发光过程中的能量受是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。制也有很大差异。制也有很大差异。制也有很大差异。绿色荧光蛋
38、白的发光机制绿色荧光蛋白的发光机制475nm504nm绿色荧光蛋白的发光机制绿色荧光蛋白的发光机制绿色荧光蛋白的发光机制绿色荧光蛋白的发光机制n n在离体状态下在离体状态下在离体状态下在离体状态下GFPGFP对高温对高温对高温对高温(70OC)(70OC)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶和大多数普通酶和大多数普通酶和大多数普通酶( (链霉蛋白酶除外链霉蛋白酶除外链霉蛋白酶除外链霉蛋白酶除外) )有较强抗性有较强抗性有较强抗性有较强抗性n nGFPGFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗
39、光融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。n n但因为但因为但因为但因为GFPGFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFPGFP灵敏灵敏灵敏灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。度可能低于某些酶类报告蛋白。度可
40、能低于某些酶类报告蛋白。度可能低于某些酶类报告蛋白。n n由于由于由于由于GFPGFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此源反应底物，因此源反应底物，因此源反应底物，因此GFPGFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白作为一种广泛应用的活体报告蛋白作为一种广泛应用的活体报告蛋白作为一种广泛应用的活体报告蛋白, ,其作用其作用其作用其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。是任何其它酶类报告蛋白无法比
41、拟的。是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。GFP的其他生化特性的其他生化特性 GFP作为标记蛋白的优点作为标记蛋白的优点 荧光稳定荧光稳定检测方便检测方便无种属特异性，也无有细胞种类和位置的限制无种属特异性，也无有细胞种类和位置的限制GFPGFP对受体细胞基本无毒害对受体细胞基本无毒害易于构建载体，不受假阳性干扰易于构建载体，不受假阳性干扰不需任何反应底物和辅助因子不需任何反应底物和辅助因子可制成永久标本可制成永久标本灵敏度高灵敏度高GFP基因的改进基因的改进n n更换更换更换更换GFPGFP生色团氨基酸生色团氨基酸生色团氨基酸生色团氨基酸n n改变碱基组成改变碱基组成改变碱基组成改变碱基组成n
42、 n除去除去除去除去GFPGFP基因中隐蔽剪接位点基因中隐蔽剪接位点基因中隐蔽剪接位点基因中隐蔽剪接位点n n插人植物内含子插人植物内含子插人植物内含子插人植物内含子n n更换强启动子等突变体更换强启动子等突变体更换强启动子等突变体更换强启动子等突变体GFPGFPn对密码子进行优化修饰对密码子进行优化修饰n n增加荧光强度和热稳定性，促进了生色团的折叠增加荧光强度和热稳定性，促进了生色团的折叠增加荧光强度和热稳定性，促进了生色团的折叠增加荧光强度和热稳定性，促进了生色团的折叠ZolotukhinZolotukhin等（等（等（等（19961996）改变了）改变了）改变了）改变了wtGFPwtG
43、FP基因编码区中基因编码区中基因编码区中基因编码区中8888个密码个密码个密码个密码子中的子中的子中的子中的9292个碱基而用人类基因组中常用的密码子代替，将个碱基而用人类基因组中常用的密码子代替，将个碱基而用人类基因组中常用的密码子代替，将个碱基而用人类基因组中常用的密码子代替，将GFPGFP的荧光强度提高的荧光强度提高的荧光强度提高的荧光强度提高2222倍，适合在哺乳动物细胞中高效表达。倍，适合在哺乳动物细胞中高效表达。倍，适合在哺乳动物细胞中高效表达。倍，适合在哺乳动物细胞中高效表达。人工人工人工人工GFPGFP Guohong Zhang Guohong Zhang等（等（等（等（19
44、961996）将）将）将）将GFPGFP的荧光强度提高的荧光强度提高的荧光强度提高的荧光强度提高了了了了3535倍，转染倍，转染倍，转染倍，转染16h24h16h24h后仍可稳定地测定荧光。后仍可稳定地测定荧光。后仍可稳定地测定荧光。后仍可稳定地测定荧光。增强型增强型增强型增强型GFPGFP 将将将将wtGFPwtGFP中的中的中的中的Ser65Ser65用用用用 ThrThr替代，得到突变体。替代，得到突变体。替代，得到突变体。替代，得到突变体。S65T-S65T-GFPGFP，激发谱，激发谱，激发谱，激发谱 中只有一个峰，且红移至中只有一个峰，且红移至中只有一个峰，且红移至中只有一个峰，且
45、红移至490nm490nm，用蓝光即，用蓝光即，用蓝光即，用蓝光即可激发可激发可激发可激发RSFPRSFP，使之更适于普通荧光显微镜观察。，使之更适于普通荧光显微镜观察。，使之更适于普通荧光显微镜观察。，使之更适于普通荧光显微镜观察。红移荧光蛋白红移荧光蛋白红移荧光蛋白红移荧光蛋白 双突变体双突变体双突变体双突变体Y66H/Y145FY66H/Y145F能在能在能在能在381nm381nm光的激发下产生光的激发下产生光的激发下产生光的激发下产生445nm445nm的蓝光，故称的蓝光，故称的蓝光，故称的蓝光，故称BFPBFP。这种蓝光能进一步激发。这种蓝光能进一步激发。这种蓝光能进一步激发。这种
46、蓝光能进一步激发GFPGFP产生绿光，即产生绿光，即产生绿光，即产生绿光，即发生荧光共振能量转移现象（发生荧光共振能量转移现象（发生荧光共振能量转移现象（发生荧光共振能量转移现象（FRETFRET） 。蓝色荧光蛋白蓝色荧光蛋白蓝色荧光蛋白蓝色荧光蛋白EBFPEBFP：增强蓝色荧光蛋白；：增强蓝色荧光蛋白；：增强蓝色荧光蛋白；：增强蓝色荧光蛋白；ECFPECFP：增强蓝绿色荧光蛋白：增强蓝绿色荧光蛋白：增强蓝绿色荧光蛋白：增强蓝绿色荧光蛋白EGFPEGFP：增强绿色荧光蛋白；：增强绿色荧光蛋白；：增强绿色荧光蛋白；：增强绿色荧光蛋白；EYFPEYFP：增强黄色荧光蛋白：增强黄色荧光蛋白：增强黄色
47、荧光蛋白：增强黄色荧光蛋白绿色荧光蛋白变异体的发色基团结构绿色荧光蛋白变异体的发色基团结构绿色荧光蛋白变异体的发色基团结构绿色荧光蛋白变异体的发色基团结构基于基于GFP的传感器的传感器 一种被修饰过的用来感应锌离子浓度的蓝色荧光蛋白：当红一种被修饰过的用来感应锌离子浓度的蓝色荧光蛋白：当红色的锌离子连接到蓝色的被修饰过的发色团上后，蛋白质会发色的锌离子连接到蓝色的被修饰过的发色团上后，蛋白质会发出亮度增强一倍的荧光从而形成容易被检测到的可见信号。出亮度增强一倍的荧光从而形成容易被检测到的可见信号。Crystal structure of a Cu-bound green fluorescent
48、 protein Zn biosensor Crystal structure of a Zn-bound green fluorescent protein biosensor 锌离子锌离子锌离子锌离子GFPGFP传感器传感器传感器传感器88mM FIP-CBSM and 88 mM CaM (panels AC) 88mM FIP-CBSM alone (panels DF).钙钙钙钙离离离离子子子子GFPGFP传传传传感感感感器器器器 pH titrations of GFPs. ( pH titrations of GFPs. (A A) Fluorescence and absorb
49、ance of GFP-S65T as a function of ) Fluorescence and absorbance of GFP-S65T as a function of pH. Data were fitted to Eq. 1 with pKa and pH. Data were fitted to Eq. 1 with pKa and n nH H parameters given in the text. For comparison, parameters given in the text. For comparison, fluorescence titration
50、 for fluorescein is shown (- - -). (fluorescence titration for fluorescein is shown (- - -). (B B) Fluorescence of GFP-F64L/S65T, ) Fluorescence of GFP-F64L/S65T, GFP-Y66H, and GFP-T203I as a function of pH with curve fits as in GFP-Y66H, and GFP-T203I as a function of pH with curve fits as in A A.
51、.pH-GFPpH-GFP传感器传感器传感器传感器GFP在生物研究中的应用在生物研究中的应用GFP在动物学研究中的应用在动物学研究中的应用n nGFPGFP作为新型报告基因用于转基因研究作为新型报告基因用于转基因研究作为新型报告基因用于转基因研究作为新型报告基因用于转基因研究 作为报告基因构建基因工程载体。以作为报告基因构建基因工程载体。以作为报告基因构建基因工程载体。以作为报告基因构建基因工程载体。以GFPS65TGFPS65T基因作为筛选标基因作为筛选标基因作为筛选标基因作为筛选标记的新型克隆载体，以绿白斑筛选法筛选阳性重组子，替代记的新型克隆载体，以绿白斑筛选法筛选阳性重组子，替代记的新
52、型克隆载体，以绿白斑筛选法筛选阳性重组子，替代记的新型克隆载体，以绿白斑筛选法筛选阳性重组子，替代LaczLacz蓝白蓝白蓝白蓝白斑筛选，不需斑筛选，不需斑筛选，不需斑筛选，不需X X一一一一galgal。n nGFPGFP融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互作用融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互作用融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互作用融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互作用 Hale C.A.Hale C.A.等利用等利用等利用等利用 GFPGFP标记，研究了可溶性微管蛋白标记，研究了可溶性微管蛋白标记，研究了可溶性微管蛋白标记，研究了可溶性微管蛋白FtsZFtsZ与其内与其内
53、与其内与其内膜受体膜受体膜受体膜受体ZipAZipA间的相互作用，发现，间的相互作用，发现，间的相互作用，发现，间的相互作用，发现，ZipA-GFPZipA-GFP融合蛋白在细胞壁溢缩融合蛋白在细胞壁溢缩融合蛋白在细胞壁溢缩融合蛋白在细胞壁溢缩前和溢缩过程中均位于前和溢缩过程中均位于前和溢缩过程中均位于前和溢缩过程中均位于FtsZFtsZ与膜相关的特殊环中与膜相关的特殊环中与膜相关的特殊环中与膜相关的特殊环中。n nGFPGFP作为一种新型免疫标记物作为一种新型免疫标记物作为一种新型免疫标记物作为一种新型免疫标记物 利用利用利用利用GFPGFP的发光特性使免疫反应呈绿色荧光从而可以直接的发光特
54、性使免疫反应呈绿色荧光从而可以直接的发光特性使免疫反应呈绿色荧光从而可以直接的发光特性使免疫反应呈绿色荧光从而可以直接观察，可望取代传统的标记技术，建立特异、灵敏、简便和快观察，可望取代传统的标记技术，建立特异、灵敏、简便和快观察，可望取代传统的标记技术，建立特异、灵敏、简便和快观察，可望取代传统的标记技术，建立特异、灵敏、简便和快速的免疫诊断新方法。岳莉莉等成功地实现了速的免疫诊断新方法。岳莉莉等成功地实现了速的免疫诊断新方法。岳莉莉等成功地实现了速的免疫诊断新方法。岳莉莉等成功地实现了gfpgfp与与与与HBVeHBVe抗原抗原抗原抗原基因融合后在大肠杆菌和昆虫细胞中高效表达，得到既能发射
55、基因融合后在大肠杆菌和昆虫细胞中高效表达，得到既能发射基因融合后在大肠杆菌和昆虫细胞中高效表达，得到既能发射基因融合后在大肠杆菌和昆虫细胞中高效表达，得到既能发射荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白，为获得一种新型发光免荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白，为获得一种新型发光免荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白，为获得一种新型发光免荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白，为获得一种新型发光免疫诊断试剂奠定了基础。疫诊断试剂奠定了基础。疫诊断试剂奠定了基础。疫诊断试剂奠定了基础。GFP在动物学研究中的应用在动物学研究中的应用GFP在植物研究中的应用在植物研究中的应用n n作为报告基因用于转基因植物研究作为报告基
56、因用于转基因植物研究作为报告基因用于转基因植物研究作为报告基因用于转基因植物研究 GFPGFP作为新型报告基因用于植物的遗传转化，可以替代与筛选作为新型报告基因用于植物的遗传转化，可以替代与筛选作为新型报告基因用于植物的遗传转化，可以替代与筛选作为新型报告基因用于植物的遗传转化，可以替代与筛选有关的抗生素或抗除草剂标记基因，既优化植物遗传转化过程，有关的抗生素或抗除草剂标记基因，既优化植物遗传转化过程，有关的抗生素或抗除草剂标记基因，既优化植物遗传转化过程，有关的抗生素或抗除草剂标记基因，既优化植物遗传转化过程，又使转基因植物更安全。又使转基因植物更安全。又使转基因植物更安全。又使转基因植物更
57、安全。n n用于植物基因表达调控研究用于植物基因表达调控研究用于植物基因表达调控研究用于植物基因表达调控研究 基因的表达可进行活体检测，利用基因的表达可进行活体检测，利用基因的表达可进行活体检测，利用基因的表达可进行活体检测，利用GFPGFP基因可以很方便地研究基因可以很方便地研究基因可以很方便地研究基因可以很方便地研究基因表达的时空性。基因表达的时空性。基因表达的时空性。基因表达的时空性。AspuriaAspuria等等等等(2002)(2002)将将将将GFPGFP与受生长素诱导的与受生长素诱导的与受生长素诱导的与受生长素诱导的启动子重组后导入植物，用生长素诱导后，通过观察侧根的分生启动子
58、重组后导入植物，用生长素诱导后，通过观察侧根的分生启动子重组后导入植物，用生长素诱导后，通过观察侧根的分生启动子重组后导入植物，用生长素诱导后，通过观察侧根的分生组织中是否有组织中是否有组织中是否有组织中是否有 GFPGFP的积累来证明生长素的时空表达。的积累来证明生长素的时空表达。的积累来证明生长素的时空表达。的积累来证明生长素的时空表达。 The photograph was taken 6 days post-inoculation using a DR Hand Lamp. The green fluorescent spots (against a background of red
59、 chlorophyll fluorescence) show the expanding foci of virus-infected cells.病毒介导的病毒介导的EGFP在烟草中的表达在烟草中的表达 RNA silencing of green fluorescent protein (GFP) (center) in leaves from Nicotiana benthamiana is suppressed by an animal (left; B2 protein of flock house virus) or a plant (right) viral suppresso
60、r, leading to enhanced GFP expression (lighter green/yellow areas). GFP用于植物用于植物RNA沉默研究沉默研究n n用于植物信号转导研究用于植物信号转导研究用于植物信号转导研究用于植物信号转导研究 GFPGFP结合荧光共振能量转移结合荧光共振能量转移结合荧光共振能量转移结合荧光共振能量转移(FREP)(FREP)为研究植物信号转为研究植物信号转为研究植物信号转为研究植物信号转导也提供了新方法。例如：导也提供了新方法。例如：导也提供了新方法。例如：导也提供了新方法。例如： AllenAllen等用等用等用等用 YEP-GFP-
61、CaYEP-GFP-Ca2+2+ 传感传感传感传感器检测拟南芥保卫细胞内器检测拟南芥保卫细胞内器检测拟南芥保卫细胞内器检测拟南芥保卫细胞内CaCa2+2+ 浓度的变化，结果表明，外浓度的变化，结果表明，外浓度的变化，结果表明，外浓度的变化，结果表明，外源的源的源的源的CaCa2+2+ 和和和和 ABAABA都能引起保卫细胞内都能引起保卫细胞内都能引起保卫细胞内都能引起保卫细胞内CaCa2+2+浓度的变化。这浓度的变化。这浓度的变化。这浓度的变化。这和过去用荧光染色法观察到的结果一致。和过去用荧光染色法观察到的结果一致。和过去用荧光染色法观察到的结果一致。和过去用荧光染色法观察到的结果一致。GF
62、P在植物研究中的应用在植物研究中的应用GFP在微生物研究中的应用在微生物研究中的应用n nGFPGFP用于微生物与宿主相互作用研究用于微生物与宿主相互作用研究用于微生物与宿主相互作用研究用于微生物与宿主相互作用研究 利用利用GFP 标记基因可以研究病毒、细菌和真菌等侵染植物标记基因可以研究病毒、细菌和真菌等侵染植物的过程和机制。的过程和机制。Bowyer 等在小麦病原菌中构建了含异柠檬酸等在小麦病原菌中构建了含异柠檬酸酶启动子的酶启动子的GFP 基因，监测到基因，监测到T. yall undae 侵染小麦时的碳代侵染小麦时的碳代谢过程。谢过程。n nGFPGFP用于检测环境微生物的迁移用于检测
63、环境微生物的迁移用于检测环境微生物的迁移用于检测环境微生物的迁移 Leff 等将等将GFP克隆到基因工程菌中克隆到基因工程菌中,监测其在水环境中的监测其在水环境中的存活和去向。存活和去向。Scott 等以等以GFP 红移突变体作为标记基因红移突变体作为标记基因,有效地有效地追踪了乳酸细菌在复杂厌氧系统中的运移。追踪了乳酸细菌在复杂厌氧系统中的运移。GFP在微生物研究中的应用在微生物研究中的应用n nGFPGFP微生物传感器微生物传感器微生物传感器微生物传感器 将将将将报报报报告基因告基因告基因告基因转转转转入入入入污污污污染物代染物代染物代染物代谢谢谢谢基因的启基因的启基因的启基因的启动动动动
64、子中可子中可子中可子中可设计设计设计设计出出出出生物生物生物生物传传传传感器感器感器感器, ,当特定的当特定的当特定的当特定的污污污污染物存在染物存在染物存在染物存在时时时时即启即启即启即启动动动动。IkenoIkeno等分别等分别等分别等分别以以以以GFP GFP 和和和和Ps Ps 作为报告基因和启动子，转入作为报告基因和启动子，转入作为报告基因和启动子，转入作为报告基因和启动子，转入E. coli E. coli 重组子重组子重组子重组子中，用以检测水体中微量的苯衍生物。中，用以检测水体中微量的苯衍生物。中，用以检测水体中微量的苯衍生物。中，用以检测水体中微量的苯衍生物。Roberto
65、Roberto 等以等以等以等以GFP GFP 作为报告基因，设计出可检测环境中亚微克级含量的砷和作为报告基因，设计出可检测环境中亚微克级含量的砷和作为报告基因，设计出可检测环境中亚微克级含量的砷和作为报告基因，设计出可检测环境中亚微克级含量的砷和砷酸盐的生物传感器。砷酸盐的生物传感器。砷酸盐的生物传感器。砷酸盐的生物传感器。 Moller 等研究发现等研究发现GFP 标记的标记的P. putidaRI 细菌主要细菌主要聚集在生物膜的表层，而聚集在生物膜的表层，而Acinetobacter sp. C6 则附着在则附着在生物膜底层生长。生物膜底层生长。研究生物膜的生长特性及其菌落特性研究生物膜
66、的生长特性及其菌落特性研究生物膜的生长特性及其菌落特性研究生物膜的生长特性及其菌落特性C6:red R1:blueGFP在微生物研究中的应用在微生物研究中的应用n nGFPGFP在真菌研究中的应用在真菌研究中的应用在真菌研究中的应用在真菌研究中的应用 （1 1）GFPGFP基因通过随机插入真菌基因组的方法基因通过随机插入真菌基因组的方法基因通过随机插入真菌基因组的方法基因通过随机插入真菌基因组的方法, ,已经被成功已经被成功已经被成功已经被成功地用来研究真菌的生态、生防菌对病原菌的侵染模式及病原地用来研究真菌的生态、生防菌对病原菌的侵染模式及病原地用来研究真菌的生态、生防菌对病原菌的侵染模式及
67、病原地用来研究真菌的生态、生防菌对病原菌的侵染模式及病原菌与其寄主的关系等菌与其寄主的关系等菌与其寄主的关系等菌与其寄主的关系等 （2 2）GFPGFP基因通过与目标基因融合的方法基因通过与目标基因融合的方法基因通过与目标基因融合的方法基因通过与目标基因融合的方法, ,则被广泛地用于真则被广泛地用于真则被广泛地用于真则被广泛地用于真菌的基因转录规则、蛋白质及细胞器定位、细胞亚结构和蛋菌的基因转录规则、蛋白质及细胞器定位、细胞亚结构和蛋菌的基因转录规则、蛋白质及细胞器定位、细胞亚结构和蛋菌的基因转录规则、蛋白质及细胞器定位、细胞亚结构和蛋白质功能等研究白质功能等研究白质功能等研究白质功能等研究.
68、 . GFP在生物医学中的应用n n药物筛选药物筛选药物筛选药物筛选 利用利用利用利用GFPGFP荧光探针，从数量众多的化合物中判断出那些荧光探针，从数量众多的化合物中判断出那些荧光探针，从数量众多的化合物中判断出那些荧光探针，从数量众多的化合物中判断出那些化合物具有与信号分子相似的，能引起配体化合物具有与信号分子相似的，能引起配体化合物具有与信号分子相似的，能引起配体化合物具有与信号分子相似的，能引起配体- -受体复合物迁移受体复合物迁移受体复合物迁移受体复合物迁移并介导生理反应的功能。如介导糖皮质激素受体（并介导生理反应的功能。如介导糖皮质激素受体（并介导生理反应的功能。如介导糖皮质激素受
69、体（并介导生理反应的功能。如介导糖皮质激素受体（hGR)hGR)迁移迁移迁移迁移药物的筛选模型的成功构建。药物的筛选模型的成功构建。药物的筛选模型的成功构建。药物的筛选模型的成功构建。n n用于临床检验用于临床检验用于临床检验用于临床检验n n示踪病原菌示踪病原菌示踪病原菌示踪病原菌 GFP在肿瘤研究中的应用n n GFPGFP在肿瘤研究中的应用在肿瘤研究中的应用在肿瘤研究中的应用在肿瘤研究中的应用GFPGFP在蛋白质细胞定位中的应用在蛋白质细胞定位中的应用在蛋白质细胞定位中的应用在蛋白质细胞定位中的应用 An image of a single mamalian cell with gree
70、n-to-red An image of a single mamalian cell with green-to-red fluorescent Dendra marking fibrillarin, a protein concentrated fluorescent Dendra marking fibrillarin, a protein concentrated in nucleoli, which are small, round bodies in the cells nucleus, in nucleoli, which are small, round bodies in t
71、he cells nucleus, composed of protein and RNA. composed of protein and RNA. 科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑细胞的活动科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑细胞的活动科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑细胞的活动科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑细胞的活动 随着病毒在宿主体内不断扩散，通过跟踪发出的绿光就随着病毒在宿主体内不断扩散，通过跟踪发出的绿光就随着病毒在宿主体内不断扩散，通过跟踪发出的绿光就随着病毒在宿主体内不断扩散，通过跟踪发出的绿光就可观察病毒的扩散途径；或者把它接合到一种蛋白质上并通可观察病毒的扩散途径；或者把它接合到一种蛋白质上并
72、通可观察病毒的扩散途径；或者把它接合到一种蛋白质上并通可观察病毒的扩散途径；或者把它接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动。过显微镜观察它在细胞内部的移动。过显微镜观察它在细胞内部的移动。过显微镜观察它在细胞内部的移动。a. a.线粒体；线粒体；线粒体；线粒体；b.b.肌动蛋白；肌动蛋白；肌动蛋白；肌动蛋白；c. c.微管蛋白微管蛋白微管蛋白微管蛋白d.d.高尔基体；高尔基体；高尔基体；高尔基体；e. e.纽蛋白；纽蛋白；纽蛋白；纽蛋白；f. f.组蛋白组蛋白组蛋白组蛋白Localisation of the ER targeted form of GFP Roots from
73、Arabidopsis plants transformed with a construct containing the cyclin B1;1promoter, cyclinB1;1 gene fused to GFP. Cells fluorescing in green are in mitosisGFP转基因生物转基因生物发绿光的老鼠发绿光的老鼠 1997年年7月日本大阪大学的科研人员首次培育出能月日本大阪大学的科研人员首次培育出能够夜里发光的含有绿色荧光蛋白的老鼠。够夜里发光的含有绿色荧光蛋白的老鼠。 1998年，年，Eduardo Kac通过转基因技术培育出第一条通过转基因技术
74、培育出第一条可以发出绿色荧光的狗。可以发出绿色荧光的狗。发绿光的狗发绿光的狗转转GFP基因的蜜蜂基因的蜜蜂转转GFP基因的蝾螈（基因的蝾螈（斑马鱼斑马鱼斑马鱼斑马鱼） 转转GFP基因的兔子基因的兔子GFP基因在蛾子的眼部表达基因在蛾子的眼部表达 2004年年7月月12日韩国科学家成功培育出身体可发出荧光日韩国科学家成功培育出身体可发出荧光的转基因鸡。的转基因鸡。 发荧光的鸡发荧光的鸡发红光的猫发红光的猫 韩国科学家采用基因工程技术克隆的韩国科学家采用基因工程技术克隆的“荧光猫荧光猫”2007年登上年登上世界各大媒体的头条新闻。一旦暴露在紫外光线下，这种克隆猫世界各大媒体的头条新闻。一旦暴露在紫
75、外光线下，这种克隆猫就能发红色的荧光就能发红色的荧光。我国首例荧光转基因克隆猪产下荧光猪崽我国首例荧光转基因克隆猪产下荧光猪崽我国首例荧光转基因克隆猪产下荧光猪崽我国首例荧光转基因克隆猪产下荧光猪崽 2007年年1月月7日，东北农业大学刘忠华教授主持的转基因克隆猪课题日，东北农业大学刘忠华教授主持的转基因克隆猪课题获得成功。中国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪成功产下获得成功。中国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪成功产下2头具有绿色荧光头具有绿色荧光遗传特征的小猪。遗传特征的小猪。中国第一例转基因猴子在昆明落地n n南方都市报南方都市报 发布时间：发布时间： 2010-11-12 08:312010-
76、11-12 08:31 The head of a barley plant transformed with a gene for green fluorescent protein (GFP) using the gene gun. (The red head is untransformed; the green head is transformed) 基因枪介导的基因枪介导的GFP在小麦中的表达在小麦中的表达GFP canola (left) with a wild-type plant (right) under UV light. 发绿光的油菜发绿光的油菜“艺艺术术”中中的的GF
77、P调调色色板板 Bacterial colony using various GFP and GFP-like proteins (from Tsien lab Web site). 钱钱永健永健实实验验室室 细细胞胞里里的的彩彩虹虹 用产生不同颜色荧光蛋白的细菌创作的图画用产生不同颜色荧光蛋白的细菌创作的图画用产生不同颜色荧光蛋白的细菌创作的图画用产生不同颜色荧光蛋白的细菌创作的图画 科学家用九十多科学家用九十多科学家用九十多科学家用九十多种颜色的荧光蛋白种颜色的荧光蛋白种颜色的荧光蛋白种颜色的荧光蛋白“标记标记标记标记”的小鼠大脑中的小鼠大脑中的小鼠大脑中的小鼠大脑中神经细胞就像一个个神经
78、细胞就像一个个神经细胞就像一个个神经细胞就像一个个五颜六色的风筝，又五颜六色的风筝，又五颜六色的风筝，又五颜六色的风筝，又像彩虹。像彩虹。像彩虹。像彩虹。大大脑脑里里的的彩彩虹虹 神经胶质细胞，像这些星细胞，重点照顾思考神经元神经胶质细胞，像这些星细胞，重点照顾思考神经元神经胶质细胞，像这些星细胞，重点照顾思考神经元神经胶质细胞，像这些星细胞，重点照顾思考神经元的身体，包括饮食和保护。的身体，包括饮食和保护。的身体，包括饮食和保护。的身体，包括饮食和保护。 大脑彩虹图象抽象画大脑彩虹图象抽象画 此混杂又浓密的神经此混杂又浓密的神经元位于脑干的听觉区元位于脑干的听觉区 这些位于大脑皮层的神经这些
79、位于大脑皮层的神经这些位于大脑皮层的神经这些位于大脑皮层的神经元就是通常所说的大脑灰质，元就是通常所说的大脑灰质，元就是通常所说的大脑灰质，元就是通常所说的大脑灰质，参与思考和各种感觉。参与思考和各种感觉。参与思考和各种感觉。参与思考和各种感觉。 此细胞图像正在向小脑传送信此细胞图像正在向小脑传送信此细胞图像正在向小脑传送信此细胞图像正在向小脑传送信息，告诉它肌肉要怎么做息，告诉它肌肉要怎么做息，告诉它肌肉要怎么做息，告诉它肌肉要怎么做 一个脑干神经元（红色）被一个脑干神经元（红色）被一个脑干神经元（红色）被一个脑干神经元（红色）被来自其它神经元的残余信号（蓝来自其它神经元的残余信号（蓝来自其
80、它神经元的残余信号（蓝来自其它神经元的残余信号（蓝黄色）所包围黄色）所包围黄色）所包围黄色）所包围 大脑彩虹图展示神经活动大脑彩虹图展示神经活动大脑彩虹图展示神经活动大脑彩虹图展示神经活动 美国哈佛大学分子与细胞生物学教授杰夫美国哈佛大学分子与细胞生物学教授杰夫美国哈佛大学分子与细胞生物学教授杰夫美国哈佛大学分子与细胞生物学教授杰夫 李其曼在其显微镜前李其曼在其显微镜前李其曼在其显微镜前李其曼在其显微镜前 大大脑脑里里的的彩彩虹虹绿色荧光蛋白为什么重要？n钱永健如是说n n在在追踪追踪細胞內移細胞內移动动的分子上，綠色的分子上，綠色荧光荧光蛋蛋白是非常方便的道具，有助白是非常方便的道具，有助于追踪脑于追踪脑神经细胞神经细胞的的发育过程发育过程及癌及癌细胞细胞的的扩散扩散情況，情況，一举一动一举一动都逃不都逃不过过科科学学家的眼睛，家的眼睛，这这回拿回拿下下诺贝尔奖诺贝尔奖，也，也象征医学象征医学科技又向前科技又向前迈进迈进一大步。一大步。
