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1、（一）干扰引物（shRNA）设计：1、NCBI上下载基因序列2、在 sigema 网站输入基因号设计一对21 个碱基的干扰引物（上下游）3、从起始密码（ATG ）下游 25bp 开始；4、GC含量介于40%60%5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3 UTR区6、选择脱靶率低的（二）、干扰载体构建1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离）退火体系：上游：5ul下游：5ul10X M buffer 5ulH2O 35ul水浴锅 100 2min，锅里隔夜（三）、酶切plko.1 载体1、 AgeI 酶切，反应体系：plko.1 载体4ugAgeI 2ul10X AgeI buffer
2、5ulH2O 39ul37水浴 23h2、切胶回收AgeI 酶切产物， 30ul 水洗脱3、EcoRI酶切，反应体系：AgeI 酶切产物30ulEcoRI 2ul10X H buffer 5ulH2O 13ul37水浴 23h切胶回收， 30ul 水洗脱，测浓度（四）、连接连接体系：T4 连接：退火引物2ul 退火引物5ul 酶切载体1ul 酶切载体1ulSolution I 5ul T4 连接酶1ulH2O 2ul T4连接酶 Buffer 1ulH2O 2ul室温下连接4h。（五）、转化-80取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml 离心管加33ul 感受态，将连接产物加入，冰上放置30min
3、，42水浴 6090s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37摇床 1h，涂布在氨苄平板上，37， 16h。（六）、挑菌用枪头挑取5 个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37过夜培养。（七）、提质粒精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 9 页碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA 的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA 与质粒 DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在 pH 值高达 12.6 的碱性条件下， 染色体 DNA 的氢键断裂， 双螺旋结构解开而变性。质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋
4、共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的 NaAc/KAc 高盐缓冲液去调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质 SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。简明原理： 碱裂解法是基于DNA 的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA 变性， 再将 pH 值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。1、取 5ml 菌液于离心管，12000 rpm 1min ，弃上清2、向沉淀加500 ul P1
5、，震荡重悬3、加入500 ul P2 ，温和翻转68 次，充分裂解（不超过 5 min，一般 3min）4、加入700 ul P3 ，温和翻转68 次，出现白色絮状沉淀，12000 rpm 10 min5、将上清加入CS柱（已放入收集管），12000 rpm 2min，将收集管中液体加入吸附柱CP4中，12000 rpm ，1min ，弃废液6、CP4柱中加入500 ul PD ,12000rpm ，1 min ，弃液7、CP4柱中加入600 ul Pw,室温放置3 min ,12000rpm ，1 min ，弃液8、空离12000rpm ，2 min，室温放置几分钟（把乙醇蒸发）9、CP4柱
6、置于 1.5ml 离心管，向柱中心加35 ul ddH2O ，室温放置2 min ，12000rpm ，1 min。（八）、测质粒浓度打开软件， ddH2O 清洗仪器35 次，点击black ，F1，结果不大于0.2每个样品吸取1ul，于仪器上，F1，结果浓度大于500， OD值 1.881.90质粒置于 -20 ，保存（九）、细胞复苏1、 37预热 PBS ， 取 8ml PBS 于 10 ml 离心管中2、液氮中取出冻存的细胞，37水浴融化3、吸取冻存细胞于PBS中，轻混匀，室温800 rpm 3min ，去上清，加入1ml 培养基重悬，4、细胞重悬液加到含 8ml 培养基的培养皿中，37
7、， 5% CO2 ,培养（十）、细胞分盘1、吸去培养液，加入PBS 清洗2、吸去PBS ，加入1ml 胰酶， 37 培养箱消化1min3、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中， 750 rpm ，室温， 5 min4、加入 1ml 培养液重悬，按1；3 分盘（十一）、转染1、PLP1 625 ng/ 孔PLP2 625 ng/ 孔2ml 离心管PLP/VSVG 625 ng/孔混匀目的质粒625 ng/ 孔Opti 培养基500ul/ 孔2、脂质体6ul/ 孔2ml 离心管请轻混匀，室温下孵育，5 minOpti 培养基500ul/ 孔将质粒和脂
8、质体混合，轻轻混匀，室温孵育20 min3、吸去细胞培养皿中的培养液，加入3 ml PBS 清洗，加1ml 胰酶， 37消化，加培养液终止消化；收集于 5ml 离心管， 750 rpm，室温， 5 min；弃上清，加入Opti 培养液重悬4、 在六孔板中加入850ul Opti 培养液，加入包装的脂质体， 混匀后加入细胞重悬液，十字摇匀， 37，5% CO2 , 培养， 68h 后去除培养基，加入3ml 新转染培养基，继续培养两天精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 9 页（十二）、收病毒培养第四天的转染细胞，用注射器吸取培养
9、基，用0,45um 滤膜过滤到1.5ml 离心管，每管1 ml。最后向培养皿中再加3ml 转染培养基，继需培养，第二次收病毒。（十三）、病毒转染细胞1、取培养的目的细胞，吸去培养液， 加入 1ml 含 4 ug/ml polybrene 的慢病毒培养基，再加入 1 ml 病毒液，混匀， 37， 5% CO2，培养 48h2、将感染的目的细胞加到生长培养基培养，3、用适当浓度的抗生素筛选靶细胞4、收细胞（十四）、收细胞（用于提蛋白，提RNA）1、吸去培养液，加入PBS 清洗2、吸去PBS ，加入1ml 胰酶， 37 培养箱消化1min3、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将
10、液体转到5 ml 离心管中， 1000 rpm ，4， 5 min4、弃上清，加1ml PBS ，重悬，转移到1.5ml 离心管 1000 rpm ，4， 5 min5、弃上清，立刻放入液氮中保存。（十五）、冻存细胞1、准备冻存液2、吸去培养液，加入PBS 清洗3、吸去PBS ，加入1ml 胰酶， 37 培养箱消化1min4、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中， 1000 rpm ，4， 5 min5、弃上清，加入1 ml 冻存液重悬，转移到冻存管。（十六）、提蛋白1、将收集到的细胞从-140液氮中取出置于冰上，加入细胞裂解液 （已加入 PMS
11、F） ,吹打 56 次，冰上裂解30 min2、13000 rpm ， 4 ， 10min ，弃沉淀3、配制蛋白标准液，稀释至0.5 mg / ml ，配制 BCA 试剂（ A 液： B液= 50:1）4、标准液体积按0；1； 2；4；8；12；16；20 加入96 孔板，补PBS 至 20ul5、 96 孔板加 1 ul 蛋白样品， PBS 补足20 ul ，每个重复3 次6、每孔加入200ul BCA ， 37，30 min7、酶标仪560 nm 测吸光值8、将蛋白样品稀释，加入loding buffer ，4，瞬时离心，100 煮 10 min，13000 rpm ，30 s（十七）、
12、WB1. 清洗玻璃板2. 灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）（2） 按前面方法配10%分离胶， 加入 TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时待胶面升到绿带下线高度时即可。然后胶上加异丙醇，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）（3）待胶凝后，倒去胶上层异丙醇并用吸水纸吸干。（4）配 4%的浓缩胶 ,加入 TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡
13、产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。（5）将胶板安装到电泳架上（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。），倒入电泳buffer ，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。点样，marker，10 ul （上样总体积一般不超过15 l，加样孔的最大限度可加20 l 样品。）（5）将其放入电泳槽中。3. 电泳精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 9 页电泳时间一般100 V，90 m
14、in 。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。4、转膜1. 剪取一张5.5 X 8.5 的 PVDF 膜。将切好膜置于甲醇中浸泡，激活，转移到去离子水中清洗。最后在转膜buffer 中清洗。2. 在加有转膜buffer 的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块滤纸垫、一支滚棒、带胶的玻璃板。3. 在转膜盒上面铺一张滤纸垫，加入转膜buffer ，用滚棒来回擀几遍以擀走里面的气泡，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。4. 将膜铺于滤纸上；5、将玻璃板撬开，除去大玻璃板后，将浓缩胶切去，取下分离胶盖于膜上上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。最后盖上另一个滤纸垫，擀几下盖上盖子。6. 将转
15、膜槽放入转膜仪。25 V，30min 。5、封闭1、转膜后，移至含有封闭液的平皿中，室温下，摇床上，封闭2 h。2、封闭后， 1 x TBST 清洗3 次，加入一抗，4，过夜；3、回收一抗， 1 x TBST 清洗3 次，每次 10 min；4、加入二抗，室温1 h5、 弃二抗， 1 x TBST 清洗3 次，每次10 min。6、显色曝光将膜放到曝光仪上，加入显色液，曝光（十八）、提RNA1、将收集到的细胞从-140液氮中取出置于冰上，加入500 裂解液（已加入PMSF）,吹打 56 次，冰上裂解30 min2、13000 rpm ， 4 ， 5 min ，弃沉淀3、加入适量（ 350ul
16、450ul）的 RTL lysis Buffer 至离心管，重悬4、加入等体积RNA Binding Buffer 至离心管，混匀5、把HiPure RNA Mini Column 装在 2ml 收集管，转移小于700ul 混合液， 12000rpm，30s6、弃滤液，继续转移7、加 500 ul Buffer RW1 ,12000rpm ， 30 s8、弃滤液，加入650 ul Buffer RW2，12000rpm ，30 s9、弃滤液，空离10、柱子转移至1.5ml 离心管，加入30100 ul RNase Free Water 至膜中央，静止1 min， 12000rpm， 1 min
17、（十九）、 PCR 合成 cDNA解链反应体系：总 RNA 12 ul引物1 ulOligo（dT）1 ul无 RNA酶水补足8 ul70 水浴5 min；冰上5 min逆转录体系：5 X M-MLV buffer 5 uldNTP 2ulRNase 抑制剂1 ulM-MLV 1 ul无 RNA酶水8 ul总体积25 ul42， 90 min ； 70 ， 10 min PCR，-20 保存（二十）、 RT-PCR利用持家基因甘油醛 -3-磷酸脱氢酶GAPDH 作为内参基因，采用荧光定量PCR 的方法检查基因的表达水品。1、根据基因和GAPDH 的基因序列设计引物，精选学习资料 - - - -
18、 - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 9 页2、反应体系：Mix 10 ul上游引物0.5 ul下游引物0.5 ul水7 ul模板2 ul每个样品设计3 个重复，反应条件：95 变性； 60 退火，设置45 个循环。Tm 设为 95（二十一）、 soft agar底层胶制备：1、 2XDMEM 培养基预热； 1.2% 的 Agar 溶液预热；两者混合2、 加到 6 孔板中。每孔1ml ，2 个重复， 3 个对照；加入时避免产生气泡，静置20 min，凝固上层胶的制备1、 吸去培养液，加入PBS 清洗2、吸去PBS ，加入1ml 胰酶， 37 培养箱消化1
19、min3、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中， 750 rpm ，室温， 5 min4、加入 1ml 培养液重悬5、细胞计数，并稀释至适当浓度6、取 1.5 ml 2 X DMEM 与 1.5 ml 的 0.6%Agar 溶液混合，再与合适量的的细胞悬液混合（每孔加入2000个细胞），每孔加入1.5 ml 底层胶。避免产生气泡，静置，凝固7、置于37， 5% CO2，培养 1520 天。（二十二）、 BrdU1、取对数生长期细胞，在24 孔板上进行细胞爬片（每孔2 万细胞），置于37， 5% CO2培养过夜2、每孔添加500ul BrdU 溶液
20、（每毫升培养基10ulBrdu）， 37， 5% CO2培养， 30 min3、弃培养液，加入200 ul/ 孔 4% 多聚甲醛，室温，30 min4、弃多聚甲醛，PBS 摇床清洗3 次，每孔500 ul ，每次5min5、加入500 ul 0.1% Triton-100 ，室温， 10 min6、PBS 摇床清洗3 次，每孔500 ul ，每次5min7、加入500 ul/ 孔 盐酸溶液， 37 ，10 min8、PBS 摇床清洗3 次，每孔500 ul ，每次5min 9、加入500 ul/ 孔 10% 山羊血清， 37 ，封闭30min10、加入 BrdU 一抗，500ul/ 孔， 4，
21、过夜11、室温复温45 min12、PBS 摇床清洗3 次，每孔500 ul ，每次5min13、加入荧光二抗，500ul/ 孔，室温， 120 min14、加入 DAPI ， 50 ul/ 孔 ，室温，避光，30 min15、PBS 摇床清洗3 次，每孔500 ul ，每次5min16、取出玻片，滴加抗荧光淬灭剂，封片（二十三）、 MTT(一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C 的作用下，生成蓝色的formazan 结晶，生成量仅与和细胞数目成正比，死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT 还原，无法形成结晶，该结晶溶解于DMSO。490nm 处测 OD
22、 值1、 取对数期细胞，计数，稀释2、 取 96 孔板，每孔加30000 个细胞，重复4 个复孔，置于37， 5% CO2培养3、 选择对应时间点的细胞，每孔加入20ul 的 MTT 溶液，置于37， 5% CO2培养 44、 取出细胞板，吸去液体，每孔加入200ulDMSO 溶液，置于摇床上，10min5、 490nm 测吸光值（二十四）、 GST pull-down（通过已经标记的GST标签蛋白，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白，用以确定已知蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，GST 标签的A 蛋白（ GST -A）与另一标签的B 蛋精选学习资料 - - - - - -
23、- - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 9 页白）GST -A 蛋白的 beads 制备1.把 GST -A（pGEX 载体）质粒转化到感受态细胞BL21（DE3）中。转化：冰上放置30 min，42 热激45s，冰上放置2 min。2.加入适量LB 无 Kana 液体培养基摇菌1 h，37 ， 220 rpm/min 。3.把菌液转移到摇菌管中，5 ml LB+Kana，37 ， 220 rpm/min 小摇过夜。4.把 5 ml 小摇过夜的菌液转移到150 ml LB+Kana 培养基中，继续37 ， 220 rpm/min 摇菌45 h。5.加入IPTG 使其
24、终浓度为0.5 mM，低温诱导45 h（一般设置为22 ）。6.5 000 rpm/min ，离心10 min 收菌体沉淀-80 保存。7.用 10 ml GST Extraction buffer 重悬菌体沉淀，涡旋震荡混匀（具体用多少重悬视菌体沉淀量而定）。8.超声处理样品。 （注意：一定要在冰上进行，此步非常重要。超声探头使用前请用酒精擦洗并用ddH2O 擦洗。探头放在液面中间，不碰壁，不触底。仪器设置为5 s 工作， 15 s 休息，防止产热过量）。9.15 000 rpm/min ，4 ，离心30 min。10.每个样品100ul Glutathione Sepharose （GST
25、 beads，用量自定），冰PBS 洗 2 遍， GST Extraction buffer 洗一遍，每次500 g/min ，离心5 min，4 。11.转移离心后的菌液上清到Glutathione Sepharose 中， 4 转动孵育1 h。12.500 g/min ， 5 min， 4 ， 去上清。用 GST Wash 洗3 遍 （至少用5 倍 beads 体积的溶液去洗。 每次500 g/min ，4 离心5 min ）。13.用 GST Extraction buffer 洗 5 遍（至少用5 倍 beads 体积的溶液去洗。每次500 g/min ，4 离心 5 min）。14.
26、用 GST Wash 洗 2 遍（至少用5 倍 beads 体积的溶液去洗。每次500 g/min ，4 离心5 min）。15.纯化好的带有GST -A 蛋白的GST beads 保存在GST Wash 中， 4 保存（这是由GST beads 特性决定的，请尽早使用）。His-B 蛋白的纯化16.菌体沉淀制备过程类似于GST -A，8 000 rpm/min ，离心2 min 收沉淀。 具体纯化过程因为篇幅所限就不在此讲述了。17.当然， 也可以用细胞裂解液来做pull-down ，那么这就不能算是纯粹的体外验证蛋白与蛋白相互作用的实验了，再此不多做讲述。GST pull-down1. 纯
27、化好的GAT-A beads 在使用前用冰PBS 洗 3 遍，每遍500 g/min ，4 离心5 min 。2. 加入适量的His-B 纯化蛋白（作者君认为10ug 的量做pull-down 已经足够了），binding buffer 是 PBS 。3. 4 转动孵育1 h。4. 洗去非特异性结合：作者君一般是用GST Wash buffer 洗 510 遍，具体次数看两者的结合强弱，需要自己摸索。（当然有protocol 介绍是用PBS 去洗，每次离心之前在4 转动孵育510 min ，这样清洗效果相对较弱，具体怎么洗看自己喽）。5. 清洗结束后就可以加loading 去煮蛋白跑WB 了。
28、不过如果你需要跑出来更漂亮的WB 条带，可以把pull-down 后的样品用GST 洗脱液（购自生工，觉得买一瓶后用一辈子也用不完）把蛋白洗脱下来：在pull-down 样品中加入100 ul GST 洗脱液（用量自定），4 转动孵育30 min，500 g/min ，4 离心 5 min，上清就是您想要的pull-down 样品。（二十五）石蜡切片免疫组化实验免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质 )，对其进行定位、定性及定量的研究。根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化
29、学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三种最常用。实验方法原理根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG 分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。实验步骤一、组织块包埋1、固定 : 10% 甲醛24h 42、PBS清洗10min/ 次6 次或更多3、自动脱水机脱水浸蜡精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 9 页4、包埋（包埋机提前30min 预开启）5、修整、切片（47um）6、贴片水温 45467、脱蜡：切片置于67烘箱中，烘片2 小时。8、洗片：二甲苯810 m
30、in二甲苯810 min1/2 二甲苯810 min无水乙醇5min无水乙醇5min95%乙醇5min93%乙醇5min85%乙醇5min75%乙醇5min9、 苏木素染色，自来水冲洗10、1%HCl分化，自来水冲洗，氨水返蓝，12min11、伊红染色12、自来水冲洗13、75%乙醇2min 二甲苯810 min85%乙醇2min 二甲苯810 min95%乙醇2min 1/2 二甲苯810 min95%乙醇2min 无水乙醇5min无水乙醇5min14、二甲苯透明，2X5min15、中性树胶封固，晾干后观察。（二十六）染色质免疫沉淀技术（CHIP ）真核生物的基因组DNA 以染色质的形式存在
31、，研究蛋白质与DNA 在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP ）能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA 与蛋白质相互作用的最佳方法。原理： 是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质DNA 复合物， 超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA 复合物，通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA 复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA 片段，通过对目的片断的纯化与检测（PCR分析），从而获得蛋白质与DNA 相互作用的信息。步骤： 1）甲醛处理细胞2）
32、收集细胞，超声破碎3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA 复合物相互结合4）加入 ProteinA，结合抗体 -靶蛋白 -DNA 复合物，沉淀5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA 复合物7）解交联，纯化富集的DNA-片断8）PCR或基因芯片分析。实验案例：证明 C/EBP与 Tmub1 启动子或增强子序列的结合实验对照：设定的对照有1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II）2、INPUT对照（ DNA 片段在沉淀以前，收集下来的对照）3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附， Normal Mouse IgG ）EZ
33、-ChIP?染色质免疫共沉淀实验流程（ Upstste Catalog # 17-371)1、Kit Description ：试剂盒内含的RNA聚合酶 II 阳性对照抗体2、试剂盒组分：A. Provided Kit Components 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 9 页Store at 4 :ChIP Blocked Protein G Agarose 1.5 mlChIP Dilution Buffer, One vial containing 24 mlLow Salt Immune Complex Was
34、h Buffer 24 mlHigh Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlLiCl Immune Complex Wash Buffer 24 mlTE Buffer 24 ml0.5 M EDTA 250 ul5 M NaCl 500 ulSDS Lysis Buffer 10 ml1 M Tris-HCl, pH 6.5 500 ul10X Glycine 11 ml10X PBS 24 ml Store at -20：Protease Inhibitor Cocktail II （蛋白酶抑制剂）2110 ulRNase A 600 ug of RNa
35、se A in60 ul sterile water.Proteinase K 600 ug of ProteinaseK in 60 ul 1M NaHCO3 600 ulAnti-RNA Polymerase II 25ug clone CTD4H8.Normal rat IgGStore at Room Temperature:20% SDS 242 ul of 20% SDS.Spin Filters One bag containing 22 Spin Filterswith Collection TubesCollection Tubes 22 Collection Tubes.B
36、ind Reagent A 25 ml of Bind Reagent A.Wash Reagent B 12.5 ml of Wash Reagent B.Elution Reagent C 1.5 ml of Elution Reagent C.4、CHIP 操作流程A. 细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解预先准备：1) 准备细胞， 150 mm 培养瓶（ 20ml 培养液）密度为80-90%，细胞数量1 x 10-7 个；2) 准备 42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water), 放入 150 mm 培养皿以冰块预冷；3) 取出 SDS Lysi
37、s Buffer ，放置至常温确保SDS溶解不析出；4) Protease Inhibitor Cocktail II 恢复至室温。正式步骤：1) 于培养瓶中加入终浓度为1%的甲醛，室温孵育10min；2) 每个培养皿加入2 ml 10X Glycine（甘氨酸）混匀，室温放置5min，以中和甲醛反应；3) 尽可能吸取培养基，不要损伤细胞（冰上操作）；4) 以 20 ml 预冷的 1X PBS洗涤培养皿，去掉PBS ，重复洗涤1 次；5) 同时取干净试管加入2 ml 预冷 PBS ，每管加5ul Protease Inhibitor Cocktail II ；6) 每培养皿加入2 ml PBS
38、 ，刮取细胞至锥形管；7) 4离心 700rpm ，时间 5min 以沉淀细胞，去掉上清；8) 将 5ul of Protease Inhibitor Cocktail II加入 1 ml of SDS Lysis Buffer ；9) 以 1 ml of SDS Lysis Buffer重悬细胞；10) 分装细胞悬液取容积约300-400 ul 至微量离心管备用。B. 超声处理裂解DNA 1) 管子置于碎冰上，超声处理以打碎DNA，超声发热会部分降解染色质，注意在冰上操作，普通贴壁细胞约1x 10-7 个细胞 /ml 需要 10 次，每次 4-5 秒的超声处理； 超声仪基本要求： 50-10
39、0WW 功率，1-2mm 探头。2) 4离心 12000rpm ，时间 10min ，移除沉淀，留下上清。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 9 页3) 上清转移至干净的微量离心管，每管约50-100ul；C. 免疫共沉淀蛋白质/DNA 准备稀释液（Dilution Buffer,，含蛋白酶抑制剂）置于冰上备用，按照1 块胶计算（ 9 个样本）： 900ul 稀释液中加入 4.5ul Protease Inhibitor Cocktail II 。注：IP应设置阳性对照(Anti-RNA Polymerase II) 和阴性
40、对照 (Normal IgG)，阴性对照IgG应保持与目的抗体来源种属一致D. 蛋白 /DNA-复合物洗脱预先准备：将1M 的 NaHCO3 恢复至室温，使沉淀溶解。,1) 准备 Elution Buffer 以备 IP管和 input 对照管使用“见C（5）”，每管按照如下准备200ulelution buffer ：10 ul 20% SDS ，20ul 1 M NaHCO3 和 170 ul sterile, distilled water 。2) C（5） input 对照管加入200 ul Elution Buffer 放置于室温备用，步骤E备用；3) C（10）完成后，每管（IP管
41、）加入100ul Elution Buffer ，混匀于室温孵育15min；4) 3000rpm 离心 1min 以沉淀 Pellet agarose，收集上清至新离心管；5) 重复 4-5 步骤，最终收集上清约200ul。E. 逆转蛋白 /DNA 交联（留取目的DNA片段）F. 目的 DNA 的纯化取出 Spin Filter-Collection Tube（自旋过滤器 /收集管）和单独的收集管Collection Tube 备用；弃去 Spin Filter，收集管Collection Tube 里面的洗出液即为纯化的DNA，可以进行下一步实验操作或冻存于-20 .G. PCR of Co
42、ntrols1、PCR （25L体系）CompositionVolume（ L）目的 DNA1.0Primer sense（10mol/L ）0.5Primer anti -sense（10mol/L ）0.5PCR Master Mix（2x）12.5PCR H2O10.5Composition of PCR Master Mix(2x):0.05units/ul Taq DNA Polymerase in reaction buffer,4mM Mgcl2,0.4mM dNTP2、PCR扩增程序：TemperatureTime955min9430s 40Cycles5730s 40Cycles7230s 40Cycles725min44、产物用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10l（ DNA 样本 8l+上样缓冲液2l） ,电压 120V ,电泳完毕后在溴化乙锭 ( EB)中染色约15 分钟，清水漂洗后凝胶成像系统拍照。5、凝胶图片与平均光密度值阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD 值。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 9 页
