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1、第十章第十章 化学发化学发光免疫光免疫 分析技术分析技术第十章第十章 化学发光免疫化学发光免疫 分析技术分析技术第一节第一节 慨慨 述述一、化学发光一、化学发光二、化学发光效率二、化学发光效率第二节第二节 化学发光剂和标志技术化学发光剂和标志技术一、化学发光剂一、化学发光剂二、发光剂的标志技术二、发光剂的标志技术第三节第三节 化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型一、直接化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析二、化学发光酶免疫分析二、化学发光酶免疫分析三、电化学发光免疫分析三、电化学发光免疫分析四、临床运用四、临床运用思索题思索题小结小结发光免疫分析发光免疫分析: :是将发光分析和免疫
2、反响相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标志免疫分析技术。是将发光分析和免疫反响相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标志免疫分析技术。 第一节第一节 概概 述述放放射射免免疫疫技技术酶免免疫疫技技术发光光免免疫疫技技术三大经典标志技术三大经典标志技术 发光发光: :是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态较低能级跃迁到激发态较高能级，然后再前往到基态，并释放光子是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态较低能级跃迁到激发态较高能级，然后再前往到基态，并释放光子的过程。的过程。根据构成激发态分子的能量来源不同可分为根据构成激发态分子的能量来源不同可分为: :光照发光、生
3、物发光、化学发光等。光照发光、生物发光、化学发光等。 光照发光光照发光photoluminescencephotoluminescence是指发光剂荧是指发光剂荧光素经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到光素经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光荧光。荧光。 生物发光bioluminescence是指发生在生物体内的发光景象，如萤火虫的发光，反响底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的方式释放出来。 化学发光chemilu
4、minescence是指伴随化学反响过程所产生的光的发射景象。某些物质(发光剂)在化学反响时，吸收了反响过程中所产生的化学能，使反响的产物分子或反响的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的方式释放出能量，这一景象称为化学发光。一、化学发光一、化学发光一些化学反响能一些化学反响能释放足放足够的能量把参与反响的物的能量把参与反响的物质激激发到能到能发射光的射光的电子激子激发态，假假设被激被激发的是一个反响的是一个反响产物物分子，那么分子，那么这种反响种反响过程叫直程叫直接化学接化学发光。反响光。反响过程可程可简单地描画如下：地描画如下：A十十BC*C*Ch其中其中
5、为光子，光子，C*表示表示C处于于单线激激发态。假假设激激发能能传送到另一个未参与化学反响送到另一个未参与化学反响的分子的分子D D上，使上，使D D分子激分子激发到到电子激子激发态，D D分子从激分子从激发态回到基回到基态时发光，光，这种种过程叫程叫间接化学接化学发光。反响光。反响过程可表示如下：程可表示如下： A A十十B C*B C* C* C*十十D CD C十十D*D* D* D D* D十十hh 化学发光效率决议于生成激发态产物分子的化学激发效率CE和激发态分子的发射效率EM。化学发光反响的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决议，每一个发光反响都具有其特
6、征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。二、化学发光效率二、化学发光效率第二节第二节 化学发光剂和标志技术化学发光剂和标志技术 在化学发光反响中参与能量转移并最终以发射光子的方式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。 一、化学发光剂一、化学发光剂能作能作为化学化学发光光剂的条件：的条件：发光的量子光的量子产率高；率高；它的物理它的物理- -化学特性要与被化学特性要与被标志或志或测定的定的 物物质相匹配；相匹配；能与抗原或抗体构成能与抗原或抗体构成稳定的偶定的偶结合合物；合合物； 其化学其化学发光常是氧化反响的光常是氧化反响的结果；果；在所运用的在所运用的浓度范度范围内内对生物体没有毒性。
7、生物体没有毒性。 直接化学发光剂直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反响，它们在化学构造上有产生发光的特有直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反响，它们在化学构造上有产生发光的特有基团，可直接标志抗原或抗体。基团，可直接标志抗原或抗体。 1.吖啶酯在碱性条件下被在碱性条件下被H2O2氧化氧化时,发出波出波长为470nm的光，具有很高的的光，具有很高的发光效率，其激光效率，其激发态产物物N-甲基甲基吖啶酮是是该发光反响体系的光反响体系的发光体。光体。2 2三联吡啶钌三联吡啶钌 三联吡啶钌三联吡啶钌 RU(bpy)32+ RU
8、(bpy)32+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺TPATPA在阳电极外表可同时失去一个电子而发生氧在阳电极外表可同时失去一个电子而发生氧化反响。化反响。 三联吡啶钌三联吡啶钌电化学发光剂反响原理电化学发光剂反响原理 酶促反响发光剂：酶促反响发光剂： 是利用标志酶的催化作用，使发光剂底是利用标志酶的催化作用，使发光剂底 物发光，这一类需酶催化后发光的发光剂物发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反响发光剂。称为酶促反响发光剂。 1 1鲁米诺及其衍生物鲁米诺及其衍生物 2 2AMPPDAMPPD1 1鲁米诺鲁米诺鲁米诺发光原理鲁米诺发光原理鲁米诺加强发光反
9、响原理鲁米诺加强发光反响原理 2AMPPD3-(2-螺旋金螺旋金刚烷)-4-甲氧基甲氧基-4-(3“-磷磷酰氧基氧基)苯苯-1,2-二氧二氧杂环丁丁烷1. 1. 碳二亚胺碳二亚胺EDCEDC缩合法缩合法 二、发光剂的标志技术二、发光剂的标志技术2. 2. 过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法 3 3重氮盐偶联法重氮盐偶联法 4. N-4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法羟基琥珀酰亚胺活化法 1发光剂的选择 2被标志蛋白质的性质 3标志方法的选择 4原料比 5标志率 6温度 7纯化与保管 影响标志的要素影响标志的要素第三节第三节 化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析的类型 用吖啶酯直接标志抗体用吖啶酯直接标
10、志抗体(抗原抗原)，与待测标本中相，与待测标本中相应的抗原应的抗原(抗体抗体)发生免疫反响后，构成固相包被抗发生免疫反响后，构成固相包被抗体体-待测抗原待测抗原-吖啶酯标志抗体复合物，这时只需参吖啶酯标志抗体复合物，这时只需参与氧化剂与氧化剂H2O2和和NaOH使成碱性环境，吖啶使成碱性环境，吖啶酯在不需求催化剂的情况下分解、发光酯在不需求催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接纳、记录单位时间内所由集光器和光电倍增管接纳、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从规范曲线上计算出待测抗原的含量。正比，可从规范曲线
11、上计算出待测抗原的含量。一、直接化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析发光发光Y Y Y YY Y磁微粒磁微粒被测抗原被测抗原+抗体抗体+带丫啶酯带丫啶酯标志物抗标志物抗体体Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y冲洗后冲洗后- - 夹心法心法1 1参与参与H2O2H2O2pH10pH10pH10直接化学发光的机理直接化学发光的机理磁微粒方式图磁微粒方式图Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特点
12、特点抗原和抗体结合与未结合部分抗原和抗体结合与未结合部分的易分别的易分别磁微粒技术磁微粒技术 化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析chemiluminescence enzyme chemiluminescence enzyme immunoassayimmunoassay，CLEIACLEIA是用参与催化某一化学发光反响的酶如是用参与催化某一化学发光反响的酶如辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HRPHRP或碱性磷酸酶或碱性磷酸酶(ALP)(ALP)来标志抗原或抗体，来标志抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原在与待测标本中相应的抗原( (抗体抗体) )发生免疫反响后，构成固相发生免疫反响后，构成固相
13、包被抗体包被抗体- -待测抗原待测抗原- -酶标志抗体复合物，经洗涤后，参与底物酶标志抗体复合物，经洗涤后，参与底物( (发光剂发光剂) )，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接纳，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接纳，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处置系统，计算出测定物的浓度。至计算机数据处置系统，计算出测定物的浓度。二、化学发光酶免疫分析二、化学发光酶免疫分析该分析系统采用辣根过氧化物酶该分析系统采用辣根过氧化物酶HRP标标志抗体志抗体(或抗原或抗原)，在与反响体系中的待测标，在与反响体系中
14、的待测标本和固相载体发生免疫反响后，构成固相包本和固相载体发生免疫反响后，构成固相包被抗体被抗体-待测抗原待测抗原-酶酶HRP标志抗体复合标志抗体复合物，这时参与鲁米诺发光剂、物，这时参与鲁米诺发光剂、H2O2和化学和化学发光加强剂使产生化学发光。发光加强剂使产生化学发光。 辣根过氧化物酶标志的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标志的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标志化学发光免疫分析表示图辣根过氧化物酶标志化学发光免疫分析表示图 该分析系统以碱性磷酸酶该分析系统以碱性磷酸酶标志抗体标志抗体(或抗原或抗原)，在与反响体系中的待测标本和固相载体发，在与反响体系中的待测标本和固相载体发生免疫反响后，构成
15、固相包被抗体生免疫反响后，构成固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶标志抗体复合物，这时参与酶标志抗体复合物，这时参与AMPPD发光发光剂，碱性磷酸酶使剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而脱去磷酸根基团而发光。发光。 碱性磷酸酶标志的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标志的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标志化学发光免疫分析表示图碱性磷酸酶标志化学发光免疫分析表示图 分析步骤分配样品分配样品,磁颗粒磁颗粒和试剂和试剂孵育孵育使反响物使反响物结合结合在磁场中在磁场中清洗去除清洗去除未结合物质未结合物质参与参与底物底物产生产生信号信号孵育孵育,促使信号促使信号的产生的产生信号信号检测检测电化学发光免疫分析电化
16、学发光免疫分析electrochemiluminescence immunoassayelectrochemiluminescence immunoassay， ECLIA ECLIA是以电化学发光剂三联吡啶钌标志是以电化学发光剂三联吡啶钌标志 抗体抗体( (抗原抗原) )，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)为电子供体，为电子供体， 在电场中因电子转移而发生特异性化学发光在电场中因电子转移而发生特异性化学发光 反响，它包括电化学和化学发光两个过程。反响，它包括电化学和化学发光两个过程。 三、电化学发光免疫分析三、电化学发光免疫分析在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体在电化学发光免
17、疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体包被抗体( (抗原抗原) )，用三联吡啶钌标志抗体，用三联吡啶钌标志抗体( (抗原抗原) )，在，在反响体系内待测标本与相应的抗原反响体系内待测标本与相应的抗原 ( (抗体抗体) )发生免疫反发生免疫反响后，构成磁性微粒包被抗体响后，构成磁性微粒包被抗体- -待测抗原待测抗原- -三联吡啶钌三联吡啶钌标志抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同标志抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引人时引人TPATPA缓冲液。当磁性微粒流经电极外表时，被安缓冲液。当磁性微粒流经电极外表时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标志抗体装在电极下面的电磁铁
18、吸引住，而未结合的标志抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反响，使三联吡啶钌和学发光反响，使三联吡啶钌和TPATPA在电极外表进展电子在电极外表进展电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。成正比。电化学发光免疫分析表示图电化学发光免疫分析表示图电化学发光免疫测定表示图电化学发光免疫测定表示图标志磁颗粒在电场中发光任务表示图标志磁颗粒在电场中发光任务表示图 1. 1.甲状腺激素甲状腺激素 2 2生殖激素生殖激素 3 3垂体激素和皮质激素垂体激素和皮质激素 4 4贫血因
19、子贫血因子 5 5肿瘤标志物肿瘤标志物 6 6感染性疾病感染性疾病 7 7糖尿病糖尿病 胰岛素、血清胰岛素、血清C-C-肽、血浆胰高糖素等。肽、血浆胰高糖素等。 8 8心脏标志物心脏标志物 9 9病毒标志物病毒标志物 10 10过敏性疾病过敏性疾病 11 11治疗药物监测治疗药物监测 四、临床运用四、临床运用1 1什么是发光免疫分析？什么是化学发光免疫分析？什么是发光免疫分析？什么是化学发光免疫分析？2 2化学发光与荧光的区别？化学发光反响的条件？化学发光与荧光的区别？化学发光反响的条件？3 3什么叫化学发光剂？化学发光剂必需具备那些条件什么叫化学发光剂？化学发光剂必需具备那些条件？4 4吖啶
20、酯化学发光的原理和特点是什么？吖啶酯化学发光的原理和特点是什么？5 5酶促反响的发光剂有哪些？其发光原理和特点是？酶促反响的发光剂有哪些？其发光原理和特点是？6 6三联吡啶钌发光的原理和特点是什么？三联吡啶钌发光的原理和特点是什么？7 7三丙胺在电化学发光中起什么作用？三丙胺在电化学发光中起什么作用？8. 8. 发光剂的标志有那些方法？影响要素有那些？发光剂的标志有那些方法？影响要素有那些？9 9什么是直接化学发光免疫分析？其特点是什么？什么是直接化学发光免疫分析？其特点是什么？1010什么是化学发光酶免疫分析？其特点是什么？什么是化学发光酶免疫分析？其特点是什么？思索题思索题发光是指分子或原
21、子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再前往到基态，并释放光子的过程。化学发光是吸收了化学反发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再前往到基态，并释放光子的过程。化学发光是吸收了化学反响过程中所产生的化学能使分子激发而发光。化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反响相结合，用于检测微量抗原或抗体的标志免响过程中所产生的化学能使分子激发而发光。化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反响相结合，用于检测微量抗原或抗体的标志免疫分析技术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。疫分析技术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。小小 结结
