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1、TCRg9/d2(OT3)-Fc融合蛋白体内抗肿瘤效果研究郭阳1,2作者多单位或者几个作者不同单位的上标序号，首页页脚注明基金及作者相关信息，如下方所示。 郑静2 胡愉2 崔莲仙2 何维2，（1湖北医药学院基础医学院免疫教研室 湖北十堰 442000；2北京协和医学院基础学院中国医学科学院基础医学研究所免疫学系 北京100005）摘要非论著类文章不需要中英文摘要的，作者酌情增删。目的：研究TCRg9/d2(OT3)-Fc融合蛋白在体内抗肿瘤效果。方法：通过同位素99mTc标记技术观察TCRg9/d2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内的显像和分布，及观察TCRg9/d2(OT3)-Fc对荷瘤裸鼠肿瘤
2、生长和生存期的影响。结果：在荷瘤裸鼠体内99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc与肿瘤组织有明显的结合，并且其可抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长速度，延长小鼠生存期。结论：本研究初步证明TCRg9/d2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内有一定的抗肿瘤效果，为肿瘤靶向性抗体治疗提供了新的思路。关键词 TCRg9/d2(OT3)-Fc；肿瘤靶向治疗；荷瘤裸鼠Anti-tumor Effect of TCRg9/d2(OT3)-Fc in Nude Mice Bearing Tumor GUO Yang1,2, ZHENG Jing2, HU Yu2, CUI Lian-xian2, HE Wei2(1School
3、 of Basic Medicine,Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei 442000;2Department of Immunology,IBMS& School of Basic Medicine,CAMS & PUMC,Beijing 100005,China)Abstract: Objective To investigate the anti-tumor effects of TCRg9/d2(OT3)-Fc fusion protein in vivo. Methods We observed the imaging and dist
4、ribution of TCRg9/d2(OT3)-Fc in nude mice bearing tumor through labeling 99mTc. Meanwhile, we observed the tumor growth and survival of nude mice with the treatment of TCRg9/d2(OT3)-Fc. Results In nude mice 99mTc-TCRg9/d2(OT3)-Fc showed obvious binding ability with tumor tissue and it inhibited tumo
5、r growth in nude mice and prolong survival of mice. Conclusion Our preliminary study demonstrated the anti-tumor effect of TCRg9/d2(OT3)-Fc in nude mice bearing tumor and provide a novel strategy for tumor targeting antibody therapy.Key words: TCRg9/d2(OT3)-Fc; tumor targeting therapy; nude mice bea
6、ring tumorgd T细胞是免疫系统中的一个独特的群体，在外周淋巴细胞库中是数量较小的亚群，约占正常人外周血CD3+ T淋巴细胞总数的1%10%。gd T细胞被视为处于免疫防御系统的第一线，在抗感染和抗肿瘤过程中起到重要的防御作用1引用文献上标序号，参考文献以出现的先后顺序编号。近年来gd T 细胞在肿瘤免疫中的积极作用备受关注。在体内外的实验表明，gd T 细胞对不同性质的多种肿瘤细胞，如黑色素瘤、淋巴瘤2、卵巢癌和肺癌3等均具有良好的细胞毒作用。TCRgd与TCRab不同，其识别抗原不具有MHC分子的限制性，可以直接识别肿瘤细胞抗原4。为此，我们建立了一个构建新型抗肿瘤抗体的新策略将
7、人类 TCRgd识别肿瘤的特性通过基因工程的方法移植到一个基因工程抗体中，这样将gd T 细胞和抗体二者的优点集于一身，从而形成一种新型完全人源化的抗肿瘤抗体。TCRgd识别肿瘤抗原的主要结构域是CDR3，本项目前期发现了卵巢上皮癌组织浸润的T细胞TCR的一个CDR3的基因优势序列（OT3）5，因此我们利用昆虫表达系统表达了TCRg9/d2(OT3)-Fc融合蛋白，既保留完整TCRgd识别肿瘤抗原的特点，又兼有抗体的Fc片段。本研究主要通过同位素标记技术观察TCRg9/d2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内的显像和分布，及TCRg9/d2(OT3)-Fc融合蛋白在荷瘤裸鼠体内的治疗效果，从而初步研
8、究TCRg9/d2(OT3)-Fc在体内的抗肿瘤效果。1 材料和方法涉及统计学处理的要说明使用的统计学软件及版本，例如SPSS 16.0，及具体使用的统计学方法，例如：t检验1.1 实验动物BALB/c 裸鼠，46周，雌性，均购自中国药品和生物制品检定所啮齿类实验动物中心。饲养于中国医学科学院基础医学研究所动物中心二级动物房。1.2 细胞株SKOV3，人类卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株，以含10%FCS的DMEM-F12培养基进行贴壁培养。1.3主要试剂和仪器SnCl2，无水乙醇，葡庚糖酸钠（GH），2-亚氨基噻吩（2-IT）均为A.R，Sigma公司产品，C-18纯化柱（Sigma公司产品），
9、Na99mTcO4（北京原子高科奶站）。淋巴细胞分离液（ 天津瀚洋生物有限公司，中国）。cck-8（同仁化学，日本）。LKB 计数器（瑞典），ICON SPECT（西门子，德国），R-905活度计（中国计量科学研究院），HP 1100，Zorbax SB-C18 column, EG&E Radioflow Dectector LB509。1.4实验方法肿瘤反应性TCRg9/d2(OT3)-Fc融合蛋白的表达：利用昆虫表达系统表达TCRg9/d2(OT3)-Fc融合蛋白，实验方法见本研究前期发表文章6。荷瘤裸鼠模型的建立：取新鲜传代培养的人卵巢癌细胞SKOV3，用0.25%的胰酶消化，用PBS
10、清洗3变，重悬，计数；给裸鼠右前腋下接种1106/只人卵巢癌细胞SKOV3，标准饲养，约14 d肿瘤长至约0.5 cm3，进行下步实验。TCRg9/d2(OT3)-Fc在荷人卵巢癌（SKOV3）裸鼠体内显像实验：取0.5 mg抗体TCRg9/d2(OT3)-Fc，加入5.0 mL的2mg/mL 2-IT，避光，室温反应45 min，过PD-10柱纯化；修饰后融合蛋白TCRg9/d2(OT3)-Fc加入10 mL 100 mg/mL 葡庚糖酸纳溶液和8 mL的1 mg/mL SnCl2溶液，立即加入0.2 mL 2.1mCi的99mTc，室温反应15 min后过PD-10柱纯化分离，收集标记产品
11、，测定放射性计数并计算标记率和产率。收集2.5 mL产品，放射性活度1.7 mCi。尾静脉注射标记的融合蛋白0.2 mL（0.24mCi）,分别于于注射后10 min、3 h、7 h和24 h进行显像。采集计数为500k，采集炬阵为128128，ZOOM为3.67，能峰为140 keV，能窗20%，使用低能高分辨平行孔准直器。观察标记药物在裸鼠体内的显像情况。TCRg9/d2(OT3)-Fc c的在荷人卵巢癌（SKOV3）裸鼠体内分布实验：给每只裸鼠前腋下接种1106人卵巢癌细胞SKOV3细胞，标准饲养。当肿瘤长至约0.7 cm时，平均分成2组，每组3只，其中两组尾静脉注射99mTc-TCRg
12、9/d2(OT3)-Fc，体积0.1 mL（1.85 MBq，含抗体约2.5g）分别于用药后4 h 和24 h，从眼球取血，扭断颈椎至死，解剖，取心、肝、脾、肾、肺、胃、畅、肌肉、骨和肿瘤等主要脏器，称重，并测定放射性计数，计算每克组织摄取放射性的百分比（ID%/g）和肿瘤/非肿瘤组织放射性（T/NT）的比值。TCRg9/d2(OT3)-Fc融合蛋白的荷瘤（SKOV3）裸鼠治疗实验：荷瘤裸鼠模型的建立：方法同前。肿瘤大小为0.1 cm3时，将裸鼠随机分为2组：PBS对照组和治疗组。每次治疗剂量：PBS对照组40 mL PBS/只；抗体治疗组每只荷瘤裸鼠与肿瘤周边注射40 mL，浓度为1 mg/
13、mL（即40 mg/只）TCRg9/d2(OT3)-Fc。第一次注射记为第1天，每3 d治疗一次，共治疗4次。从第1天起每3 d观察肿瘤结节生长情况。用卡尺测量肿瘤结节的长径与短径，计算肿瘤体积。瘤体体积计算公式：瘤体体积（mm3）=a b2 0.5。a：瘤体长径（mm），b：瘤体短径（mm）。并观察各组小鼠的生存期。2结果2.1肿瘤反应性TCRg9/d2(OT3)-Fc融合蛋白的表达图1 TCRg9/d2(OT3)-Fc融合蛋白SDS-PAGE电泳图经过protein G亲和层析，得到纯度较高的TCRg9/d2(OT3)-Fc，如图1.所示，变性SDS-PAGE鉴定，g9和d2(OT3)-F
14、c两条链的大小相近，约70 KD，非变性SDS-PAGE鉴定，显示了单一条带，表明是二聚体表达。纯度达90%以上，可以用于后续实验。2.2 TCRg9/d2(OT3)-Fc在荷人卵巢癌（SKOV3）裸鼠体内显像SKOV3荷瘤裸鼠分别尾静脉注射99mTc-TCRg9/d2(OT3)-Fc选择15min、3 h、7 h和24 h四个时相进行g显像。结果如图2所示，注射后7 h左右，在荷瘤裸鼠体内99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc与肿瘤组织有明显的结合，红色箭头所指为肿瘤部位，这种结合可以一直持续到24 h。图2 99mTc-TCRg9/d2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内显像2.3 TCRg9
15、/d2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内的分布以ID%/g（每克组织摄取放射性的百分比）和T/NT（肿瘤/非肿瘤组织放射性）比值两个指标评定抗体片段在荷瘤裸鼠体内的分布，选择4 h和23 h两个时相观察其分布，结果分别如表1和图3所示。99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc融合蛋白在注射后4 h，肿瘤组织的ID%/g值为(1.290.15)（ID%/g1），说明肿瘤对抗体的摄取尚可。99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc融合蛋白在注射后的早期（4 h），肝肾等血流丰富的组织摄取率较高，显然，这与这些脏器的血流量相关。随着时间的延长，肿瘤/血液的值分别由注射99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc后4 h的（1.130.17）到提高到23 h的（2.050.28）说明99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc和肿瘤组织的结合效果随着时间的延长在一定程度上增加。表1 表格使用标准三线表，横坐标为观察指标，纵坐标为分组，数据结果有统计学差异者请上标*，#等，并在表格下方给出注解，例如：注：与组比较，*P0.0599mTc-TCRg9/d2(OT3)-Fc注射荷瘤（SKOV3）裸鼠后不同时间点在体内的分布组织4 h23 hID%/gT/NTID%/gT/NT血液1.150.061.130.170.340.022.050.28心0.500.052.640.540.240.012.880.20
