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1、实验二培养基的配制及灭菌一、实验目的：1. 掌握常用培养基的制备方法；2. 了解培养基的成分、类型及特点；3. 学会玻璃仪器的洗涤和灭菌前的准备工作。4. 了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程和分装方法。二、实验原理人工配制的培养基是植物组织培养的营养基础，不同材料对培养基的要求不尽相同，适 当地设计和选用培养基对组织培养是至关重要的，一个完整的培养基配方应包含有无机盐、 有机营养、水、植物生长调节剂、琼脂及其他成分。培养基的主要成分的详细内容见课本 p2629。为了省时和减少多次称量的误差，一般先将药品配制成浓缩一定倍数的母液，用时 稀释，储存于冰箱低温（24 摄氏度）中待用。基本培养
2、基有8 中母液，即大量元素母液、微量元素母液、有机物母液、钙盐母液、铁 盐母液、肌醇母液、镁元母液、生长调节物质母液，基本培养基的配制方法有两种：一是可 以将培养基的每种成分配成单一化合物的母液，便于配制不同种类的基本培养基时使用；二 是配成几种不同的混合液，这样在大量配制同一种培养基时更省时、省力。在配制母液时应 注意防止沉淀产生。绝大多数生长调节物质不溶于水，可以加热并不断搅拌促使溶解，必要 时加入稀酸或稀碱等物质促溶。各类植物生长调节物质的用量极小,它们对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化起着重要和明显的调节作用。通常使用的浓度单位是mg/L。配制好的培养基应在24h之内完成灭菌工作
3、，以免造成杂菌大量繁殖。灭菌方法有：高 温高压灭菌、过滤除菌、射线除菌等方法。培养基常采取高压灭菌的方法，灭菌时间一般是 在 0.105MPa 压力下，温度 121 摄氏度时，灭菌时间应根据容积的体积确定，所需最少时间 见课本P32表2一2。培养基必需保证绝对无菌，否则因其营养丰富细菌、真菌极易滋生而 导致植物死亡。灭菌后的培养基不宜马上使用，以免造成培养材料的损失。（一）、组成培养基的五类成分 目前，大多数培养基的成分是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成 的。1. 无机营养物无机营养物主要由大量元素和微量元素两部分组成，大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮，但
4、在培养 基中用硝态氮的较多，也有将硝态氮和铵态氮混合使用的。磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。钾是培养基 中主要的阳离子，在近代的培养基中，其数量有逐渐提高的趋势。而钙、钠、镁的需要则较少。培养基所需的 钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。培养基中的铁 离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeS04与Na2EDTA(螯合剂)的混合。2. 碳源培养的植物组织或细胞，它们的光合作用较弱。因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供需要。培 养基中的碳水化合物通常是蔗糖。蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。3. 维生素在培养基
5、中加入维生素，常有利于外植体的发育。培养基中的维生素属于B族维生素，其中效果最佳的有 维生素B1、维生素B6、生物素、泛酸钙和肌醇等。4. 有机附加物包括人工合成或天然的有机附加物。最常用的有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸等。另外 琼脂也是最常用的有机附加物，它主要是作为培养基的支持物，使培养基呈固体状态，以利于各种外植体的培 养。5. 生长调节物质常用的生长调节物质大致包括以下三类：(1) 植物生长素类。如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2, 4-二氯苯氧乙酸(2, 4-D)。(2) 细胞分裂素。如玉米素(Zt)、6-苄基嘌吟(6-BA或BAP)和激动素(Kt)。(3) 赤
6、霉素。组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸(GA3)。(二)、几种常用培养基特点 组织培养是否成功，在很大程度上取决于对培养基的选择。不同培养基有不同特点，适 合于不同的植物种类和接种材料。开展组织培养活动时，应对各种培养基进行了解和分析， 以便能从中选择使用。下面介绍组织培养几种常用培养基的配方见表91。培养基中的激素种类和数量，随着不同培养阶段和不同材料而有变化，因此各配方中均不列入。(1) MS培养基：MS培养基是目前普遍使用的培养基。它有较高的无机盐浓度，对保证组织生长所需的 矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存、消毒 等过程中，即使有些成分略
7、有出入，也不致影响离子间的平衡。MS固体培养基可用来诱导 愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养，它的液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得 明显成功。这种培养基中的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和 生理上的需要。因此，一般情况下，无须再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子 汁等有机附加成分。与其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量 高，这是它的明显特点。(2) B5培养基：B5 培养基的主要特点是含有较低的铵，这是因为铵可能对不少培养物的生长有抑制作用。经过试验发现，有些植物的愈伤组织和悬浮培养物在MS培养基上生长得比B5培养基上 要好，而另
8、一些植物，在B5培养基上更适宜。(3) White培养基1943年由White设计，1963年做了改良，是一个无机盐类浓度较低的培养基。其 使用也很广泛，特别适合生根培养和幼胚培养。(4) SH培养基1972年由Schenk和Hidebrandt设计，主要特点与B5相似，不用(NH4) 2SO4， 而改用NH4H2PO4，无机盐浓度较高的培养基。在不少单子叶和双子叶植物上使用效果好。 N6培养基：N6 培养基特别适合于禾谷类植物的花药和花粉培养，在国内外得到广泛应用。在组织 培养中，经常采用的还有怀特(While，1963)培养基、尼许(Ni tsch,1951)培养基等。它们 在基本成分上大
9、同小异。怀特培养基由于无机盐的数量比较低，更适合木本植物的组织培养。三、实验材料：1. MS培养基母液、植物生长调节剂母液、蔗糖、琼脂、蒸馏水、O.lmol/L NaOH、O.lmol/L HCL。2. 仪器与用具：天平(电子天平和粗天平)酸度计或精密pH试纸、水浴锅、电磁炉、高 压蒸汽灭菌器、量筒、胶头滴管、移液管及移液管架、吸耳球、烧杯、培养瓶、铝锅、 分装器、标签纸或记号笔、剪刀、镊子等。四、实验步骤(一)、培养液的配制1.制备母液 为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，
10、每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。现将培养液中各类物质制备母液的方法说明如下。(1) 大量元素。大量元素包括硝酸铵等用量较大的几种化合物。制备时，按表中排列 的顺序，以其10 倍的用量，分别称出并进行溶解，以后按顺序混在一起，最后加蒸馏水， 使其总量达到 1 升，此即大量元素母液。(2) 微量元素。因用量少，为称量方便和精确起见，应配成100倍或 1000倍的母液。 配制时，每种化合物的量加大100 倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。(3) 铁盐。铁盐要单独配制。由硫酸亚铁(FeS04 7H20)5.57克和乙二胺四乙酸二
11、钠 (NaEDTA)7.45克溶于1升水中配成。每配1升培养基，加铁盐5毫升。(4) 有机物质。主要指氨基酸和维生素类物质。它们都是分别称量，分别配成所需的 浓度(0.11.0毫克/毫升)，用时按培养基配方中要求的量分别加入。(5) 植物激素。最常用的有生长素和细胞分裂素。这类物质使用浓度很低，一般为0.0110毫克/升。可按用量的100倍或1000倍配制母液，配制时要单个称量，分别贮藏。 配制植物生长素时，应先按要求浓度称好药品，置于小烧杯或容量瓶中，用12毫升0.1N(克当量浓度)氢氧化钠溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。配制细胞分裂素时，应先用 少量0.5或1N的盐酸溶解，然后加蒸馏水至所
12、需量。以上各种混合液(母液)或单独配制药品，均应放入冰箱中保存，以免变质、长霉。至于 蔗糖、琼脂等，可按配方中要求，随称随用。试剂配方：1、大量元素(母液I ) mg / LNH4NO316500KNO319000CaCl22H2O4400MgSO47H2O3700KH2PO41700微量元素(母液II)KI83H3BO3620MnSO44H2O2230ZnSO47H2O860Na2MoO4.2H2O25CuSO45H2O2.5CoC126H2O2.53、铁盐（母液III）FeSO47H2O2780Na2-EDTA2H2O37304、有机成分（母液W）肌醇10000烟酸50盐酸吡哆醇（维生素
13、B6）50盐酸硫胺素（维生素 B1）10甘氨酸 200以上各种营养成分的用量，除了母液I为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。 上述几种母液都要单独配成1L的贮备液。母液I、母液II及母液W的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶， 最后定容到 1 L。母液III的配制方法是：将称好的FeSO47H2O和Na2-EDTA2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断 搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L,保存在棕色玻 璃瓶中。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期
14、等， 保存在冰箱的冷藏室中。MS培养基中还需要加入2, 4-二氯苯氧乙酸(2, 4-D)、萘乙酸(NAA)、6苄基嘌吟 (6-BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.1 mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg,将2, 4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙 醇预溶，将6BA用少量(1mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需 要水浴加热，最后分别定容至100 mL,即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液。配制培养液：用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液I为50 mL,母液II、III、W A和WB各5 mL。再取2, 4-D
15、 5 mL、NAA 1 mL,与各种母液一起放入烧杯中。2.配制培养基的具体操作(1) 、根据配方要求,用量筒或移液管从每种母液中分别取出所需的用量,放入同一烧 杯中,并用粗天平称取蔗糖、琼脂放在一边备用；(2) 、将中称好的琼脂加蒸馏水300400毫升，加热并不断搅拌，直至煮沸溶解呈透 明状,再停止加热；(3) 、将中所取的各种物质(包括蔗糖)，加入煮好的琼脂中，再加水至1000毫升，搅 拌均匀,配成培养基；(4) 、用1N的氢氧化钠或盐酸，滴入中的培养基里，每次只滴几滴，滴后搅拌均匀， 并用pH试纸测其pH值，直到将培养基的pH值调到5.8；(5) 、将配好的培养基，用漏斗分装到三角瓶(或试管)中，并用棉塞塞紧瓶口，瓶壁写 上号码。瓶中培养基的量约为容量的1/4或1/5培养基的成分比较复杂，为避免配制时忙乱而将一些成分漏掉，可以准备一份配制培养基的 成分单，将培养基的全部成分和用量填写清楚。配制时，按表列内容顺序，按项按量称取， 就不会出现差错。(二)、培养基的配制：根据需配制的培养基配方及配量，再按配制的各种母液的用量及 浓度，准确计算出各种母液及蔗糖、琼脂等物质的取量。愈伤组织的诱导培养配方为MS+6-BA 2.0mg/L + NAA 0.5mg/L +
