《兼具GPx2和ApSOD活性抗氧化酶的真核表达及活性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《兼具GPx2和ApSOD活性抗氧化酶的真核表达及活性研究（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、兼具GPx2和ApSOD舌性抗氧化酶的真核表达及活性研究活性氧（ROS混机体生理彳t谢的产物，不同浓度的RO制7寸机体产生有益或 有害的影响。正常生理状态下，ROS的产生和消除处于动态平衡状态，从而维持机 体氧化和抗氧化的相对平衡。然而 , 随着生态恶化、 环境污染及现代化生活不规律的程度日趋加深, 多种内在及外在因素导致ROS勺过量产生，当过多的ROSF能及时清除，与之相伴的疾病 也愈加严重和高发 , 对人类的健康造成严重威胁。机体内的抗氧化进程是复杂而 多变的 , 诸多抗氧化酶间的协同作用以维持该系统的平衡。其中超氧化物歧化酶（SOD卜过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）这三
2、种酶类抗氧化剂组成的酶学防御系统 , 相互协同作用 , 通过不同的反应有效地将机体内多余超氧阴离子（O2 -）、过氧化氢（H2O2）和多种氢过氧化物清除。SOD O2 -转化为H2O2继而被CAT GPx等将其分解为水（H2O），从而使有害 的O2-和H2O2W化为无害的水分子。如果两种抗氧化酶的协同作用被破坏，可将ROS勺损伤效应放大，从而引发 多种疾病。根据三者在清除 ROS寸的协同作用，我们认识到获得兼具两种或多种 抗氧化功能于一体的抗氧化酶, 相比单一抗氧化酶, 更有利于了解抗氧化酶协同体系的机制 , 且它也具有一定潜在的应用价值。GPxM过氧化物类底物的广泛识别和高效的催化使其在整个
3、抗氧化系统中发挥着极其重要的作用，具活性中心是由终止密码子UGAS码的硒代半胱氨酸 （Sec）,Sec需要经过特殊而复杂的翻译机制才能插入到蛋白质中。SOD乍为机体重要的抗氧化酶，是机体对抗自由基的第一道防线，它可以专一性地催化O2-发 生歧化反应生成O2和H2O2因此，制备出兼具GPx2ffi ApSODg性的抗氧化酶具有更好的科研价值和广泛的应用前景。本研究利用真核表达系统表达人胃肠道来源 GPx(GPx2和庞贝蠕虫 来源SOD(ApSOD)融合蛋白hGPx2-linker-ApSOD,通过体外催化活性测定,确定 所获得的融合蛋白具有明显的 GPx活力和SOD舌力。(1)融合蛋白编码基因的
4、设计。为了使hGPx2和ApSODS合表达时，互相不干扰蛋白折叠从而避免高级结构变化引起的活力丧失, 我们通过一段柔性肽linker(GGGGSGGGGSGGGGS|码基因将hGPx牙口 ApSO购编码基因连接，获得融合蛋白 hGPx2-linker-ApSOD 的编码基因 , 另外 , 在基因 3 端设计含有His6 标签编码序列以方便蛋白表达后检测及纯化。(2)pSel Express1-hGPx2-linker-ApSOD 表达质粒的构建分别以从人肝癌细胞株Hep G2的mRN版转录获取的c DNAK表达质粒p Cold I-ApSOD作为模板，通过PCR分别获得hGPx2-linker
5、和linker-ApSOD的基因片段，再利用重叠PCR获得 hGPx2-linker-ApSOD 的完整片段, 使用限制性内切酶Sal I/Xbal I 将质粒pSel Express1 和 hGPx2-linker-ApSOD 基因片段双酶切，再用 T4 DNA Liagse 将二者连接到一起构建出 pSel Express1-hGPx2-linker-ApSOD 表达质粒。测序鉴定所构建质粒序列与理论相符。(3)hGPx2-linker-ApSOD 的表达与纯化 pSel Express1 的多克隆位点下游包含一段硒代半胱氨酸插入序列(SECIS),目的基因转录后SECIS位于m RNA勺
6、3非编码区，能够有效的将hGPx2编码区UGA旨导翻译为Sec。将重组质粒转染至 HEK 293T细胞中进行表达。利用金属螯合亲和层析(IMAC)法纯化表达的可溶性重组蛋白hGPx2-linker-ApSOD, 通过 Western blot 鉴定重组蛋白。 (4)hGPx2-linker-ApSOD 的GPx和SOD舌力测定活力测定结果显示，hGPx2-linker-ApSOD的GPx活力为14.9 U/仙mol,为小分子模拟物 Ebselen(0.99 U/仙mol)GPx活力的15倍；该双功 能酶SOD勺活力为149.3 U/mg,与本课题组在大肠杆菌中表达的 ApSO即功能酶 的活力在同一数量级，但比SOD3勺活力低一个数量级。综上所述，本研究首次利用真核表达系统成功制备了兼具GPx和SOD舌性的hGPx2-linker-ApSOD 双功能抗氧化酶, 这为阐明双功能酶的协同作用提供了分子基础 , 同时具有一定潜在的药用价值。
