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1、何首乌提取物聚酰胺柱层析流分促血管内皮细胞生长活性研究【摘要】目的初步讨论何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法TT比色法检测何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞生长的促进作用；HE染色法观察其流分对人脐静脉血管内皮细胞形态学的影响。结果经聚酰胺柱层析洗脱的何首乌流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖具有不同的作用，其中D流分随着浓度的增加，对人脐静脉血管内皮细胞增殖具有促进作用，显微镜下观察到细胞的数量及分裂相增多，B和流分对细胞的增殖影响不大，而A流分对血管内皮细胞具有抑制生长作用，细胞的数量减少，核固缩。结论何首乌提取物聚酰胺柱层析流分中含有促人脐静脉血
2、管内皮细胞生长的活性物质。【关键词】何首乌聚酰胺柱色谱人脐静脉血管内皮细胞TT比色法HE染色法Abstrat:bjetiveTinvestigatetheprliferatineffetsnhuanubilialvEinvasularendthelialells(HUVEs)fthefratinsislatedfrPlygnuultiflrThunbextratedithplyaidelunhratgraphy.ethdsTheativityfprtingHUVEsgrthfeahfratinasbservedbyTTlrietriassay.ThehangesfHUVEsrphlgyereb
3、servedbyHEstain.ResultsThefratinselutedfrplyaidelunhratgraphyhaddifferentprliferatinativitiesnHUVEs.iththeinreasefnentratin，thefratinDuldprtethegrthandprliferatinfHUVEssignifiantly.Theellsshedrphlgialhangesignifiantlyunderirspe.parediththentrl，theellquantityanditsisfthefratinDereinreased.Hever,there
4、aslittlerneffetsntheprliferatinfHUVEsbyfratinBand.Inntrast,fratinAhadaninhibitryeffetnthegrthfHUVEs,hihausedthedereaseintheellnuberandkarypynsis.nlusinTherearesepnentsfprtingrthfHUVEsinthefratinfrplygnuultiflrThunb.Keyrds:PlygnuultiflrThunb.；Plyaidelunhratgraphy；Huanubilialveinvasularendthelialell(H
5、UVE)；TTlrietriassay；HEstain何首乌PlygnuultiflrThunb.系蓼科植物何首乌的枯燥块根，具有乌须发、悦颜色、补肝肾、抗衰老之良效1。现代药理学研究说明其醇提或水提液具有进步免疫力、抑制血小板聚集、舒张血管、抗氧化等作用，且这些作用与其中的活性成分二苯乙烯苷2,3,5,4-tetrahydrxy-stilbene-2-D-gluside有关1，2。二苯乙烯苷又称芪多酚，属多羟基芪类化合物，现代药理学研究说明，其具有去除自由基2、降低胆固醇3、保护肝脏等4作用。本实验采用TT法和HE染色法观察何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响，为何首
6、乌的进一步开发和利用提供根据。1材料与仪器1.1材料聚酰胺6080目和聚酰胺薄膜1010购于浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂；何首乌饮片购自广西医药公司；人脐静脉血管内皮细胞购自武汉大学保藏中心。1.2仪器RE-52型旋转蒸发仪(上海博通)；SHB-循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸)；紫外线检出器(日本)；二氧化碳培养箱(TherFraDEL3111)；960酶标仪；倒置相差荧光显微镜lypusXZIFSZ；生物显微镜日本lypus。1.3试剂乙醇；丙酮；甲醇(成都市科龙化工)；冰乙酸(上海实意化学试剂)；无水乙醇(重庆川江化工)；氯仿(广东省化学试剂工程技术研究开发中心),以上试剂级别均为分
7、析纯。RPI1640培养基GIBInvitrgenperatin；新生牛血清(杭州四季青生物工程材料)。自配试剂：2%三氯化铁-2%铁氰化钾显色剂；0.5%胰蛋白酶溶液；PBS；苏木精染液；伊红染液及1%稀盐酸乙醇溶液。2方法2.1何首乌流分提取别离取2kg何首乌粉用4倍量70%乙醇回流提取，浓缩后的总浸膏依次采用环己烷、醋酸乙酯、正丁醇分别进展萃龋采用聚酰胺柱层析法，以蒸馏水-乙醇为洗脱剂对正丁醇层浸膏进展别离，搜集各流分；点样，在365n处用紫外灯观察，并以2%三氯化铁-2%铁氰化钾显色跟踪检测，合并一样流分，减压浓缩。按洗脱顺序分别得到A，B，D流分组。2.2活性研究2.2.1细胞的培养
8、人脐静脉血管内皮细胞培养于含体积分数为10%热灭活新生牛血清的培养液中，置二氧化碳培养箱，在37，52条件下培养。2.2.2TT法测定细胞生长增殖实验取指数生长期细胞用0.5%胰蛋白酶消化,参加含小牛血清的培养液计数并稀释至1104个/l。将稀释的细胞悬液按100l/孔接种至96孔板,置37,5%2培养箱中孵育24h至细胞贴壁后,选择A，B，D4种流分，每组设5个浓度梯度参加至96孔板中,每个浓度设3个平行孔。同时设PBS空白对照组6孔，继续培养72h,取出孔板，每孔参加20l5g/l的TT,37、5%2条件下孵育4h,弃尽孔内液,每孔中参加200l的DS溶解TT产物。振荡30s，用酶标仪于4
9、90n处测定每个孔的吸光值A值。计算存活率：细胞存活率(%)=(用药组平均A值/对照组平均A值)100%2.2.3HE染色法观察流分对人脐静脉血管内皮细胞形态的影响取贴壁生长的细胞，用0.5%胰蛋白酶消化,参加含小牛血清的培养液计数并稀释至1104个/l。将稀释的细胞悬液按2l/孔接种至6孔板，参加已高压灭菌的盖玻片，培养24h后，参加不同浓度的流分，药物组设定如下：A流分组、D流分组，每组设两个浓度梯度，每个浓度设2个平行孔；同时设2孔空白对照组。培养24h后，取出盖玻片。用95乙醇固定，苏木精及伊红染色，乙醇脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片,摄像。3结果3.1TT实验结果不同浓度的流分
10、分别作用于人脐静脉血管内皮细胞后，采用TT法测定其对细胞生长的作用。其中流分D对人脐静脉血管内皮细胞的生长具有促进作用，出现明显的量效关系，即浓度越高，存活率越高。流分A对人脐静脉血管内皮细胞具有一定的抑制生长作用。流分B，与对照组比拟，根本无差异。结果见表1。表1何首乌提取物4种流分对人脐静脉血管内皮细胞生长的作用(略)3.2细胞形态学改变经HE染色后显微镜观察，可见正常的人脐静脉血管内皮细胞呈梭形，细胞浆丰富，均匀，细胞核规那么，呈紫蓝色，核内染色均一。A流分组对细胞具有抑制作用，光镜下观察到细胞的数量减少，局部细胞特别是高浓度组出现胞浆减少，核固缩现象。D流分组对细胞具有明显的促进生长作
11、用，尤其是高浓度组表现为细胞生长旺盛，核分裂相增多，细胞数量增多。见图1。4讨论聚酰胺是通过己内酰胺聚合而成的尼龙-6锦纶、卡普隆及由己二酸与己二胺聚合而成的尼龙-66，是一种白色多孔非晶型粉末，其分子中含有丰富的酰胺基，可与多酚类化合物的羟基或羧基形成分子间氢键而将其吸附。分子中酚羟基数目越多，芳香化程度越高的化合物与酰胺基的结合力越强，从而实现与其它物质的别离5。结合本文TT法结果可以知道，较晚洗脱出来的流分D，对人脐静脉血管内皮细胞具有促进增殖生长作用，推测流分D中促进血管内皮细胞生长的物质可能与含有酚羟基数目较多有关。但要确定酚羟基是否为促人脐静脉血管内皮细胞生长的药效团有待进一步研究
12、。血管内皮细胞在维持血管张力和血流调节方面发挥重要作用，内皮细胞还可以阻止血小板和白细胞的激活，所以完好的内皮系统在维持血管稳定和防止血栓方面发挥重要作用。临床理论证实中药何首乌提取物对生物体多种代谢活性具有积极的影响作用。本实验结果说明，在何首乌醇提物的正丁醇萃取物中含有对血管内皮细胞增殖产生促进作用的活性物质，可使细胞的分裂相增多，染色质丰富，为进一步从何首乌中别离纯化具有保护和修复血管内皮细胞的活性物质提供了根据。【参考文献】1李玉芳,何玄华.何首乌现代研究进展J.中成药,1997,19(5):37.2RyuG，JuJH，ParkYJ,etal.Theradialsavengingeff
13、etsfstilbeneglusidesfrPlygnuultiflruJ.ArhPharRes，2002，25(5):636.3ArihiH,KiuraY,kudaH,etal.EffetsfstilbenepnentsfthertsfPlygnuuspidatuSieb.etZu.nlipidetablisJ.hePharBull(Tky).1982，30(5):17664KiuraY,hinaiH,kudaH.,etal.EffetsfstilbenepnentsfthertsfplygnuSpp.nliverinjuryinperxidizedil-fedratsJ.Plantaed，1983，49(9):515斐月湖.天然药物化学实验，第4版.北京：人民卫生出版社，2022：39，54.
