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1、耐药结核病的诊治进展(全文)结核病作为全球疾病十大死因之一，是重大的公共卫生问题，其中耐药结核病(drug-resistant tuberculosis, DR-TB)是结核病控制面临的重大挑战。 WHO发布的2020年全球结核病报告显示， 2019年 全球估算新发结核病患者996万例，估算新发耐多药结核病 (multidrug-resistanttuberculosis ， MDR-TB)/ 利福平耐药结核病(rifampici n resista nt tuberculosis， RRTB)患者约 46.5 万例，登记报告 MDR-TB/RRTB 患者206 030例，占估算发病总数的44
2、%。在细菌学确诊的肺结核病例中仅61%幵展了利福平耐药检测， MDR-TB/RRTB 患者的治疗覆盖率为38%，其中中国仅为 20.8%(13525/65 000)，中国MDR-TB/RRTB 患者的治疗成功率为57%，丢失率为29%。由此可见，相当一部分结核病患者未被发现和诊断，特别是DR-TB患者，其耐药检测率较低，治疗覆盖率不足，治疗成功率低且丢失率高， 这与WHO终止结核病的目标相去甚远。因此，迫切需要加快DR-TB诊断的步伐，扩大治疗覆盖率，提高治疗成功率，减少丢失率。现围 绕DR-TB诊断和治疗进展方面进行介绍。一、DR-TB的分类根据WHO 的定义，DR-TB 分为以下几类：单耐
3、药结核病(mo no-resista nt tuberculosis, MR-TB)，对 1 种一线抗结核药物耐药；多耐药结核病(poly-resistant tuberculosis， PR-TB)，对 1 种以上的一线抗结核药物耐药，但不包括异烟肼和利福平同时耐药；RRTB，对利福平耐药，不论对其他抗结核药物是否耐药；异烟肼耐药结核病(isoniazid-resistant tuberculosis， Hr-TB)，对异烟肼耐药但对利福平敏感；MDR-TB，对包括异烟肼和利福平同时耐药在内的至少2种以上一线抗结核药物耐药；准广泛耐药结核病(pre-extensivelydrug-resis
4、tanttuberculosis ， Pre-XDR-TB)，符合MDR-TB/RRTB定义，同时对任意一种氟喹诺酮类药物耐药；广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)，符合MDR-TB/RRTB 定义，同时对任意一种氟喹诺酮类药物和至少1种其他A组药物(贝达喹啉或利奈唑胺)耐药。二、DR-TB的诊断结核病的诊断以病原学诊断为金标准，DR-TB诊断的金标准是基于培养的表型药物敏感试验(以下简称药敏试验)，其对标本的结核分枝杆 菌数量有较高要求且耗时长，不利于结核病的早期控制。近年来随着 全基因组测序技术的发展，结核分枝杆菌的
5、耐药机制被不断解析，新 的耐药诊断技术被幵发和完善。然而传统耐药诊断方法和新兴分子生 物学方法各有优劣，相互补充，主要有以下几个方面。（一）表型药敏试验分枝杆菌培养是幵展表型药敏试验的前提和基础，依据分枝杆菌培养 基的不同，主要分为固体培养和液体培养。表型药敏试验是在培养阳 性的基础上进行的，由于涉及大量活菌操作，耗时较长，所以对技术 人员操作熟练程度及实验室生物安全级别要求较高。因此，以培养的 方法来检测 DR-TB受到了限制，特别是在经济欠发达地区。（二）分子药敏试验及其进展分子生物学技术通过对耐药相关的靶基因进行检测来诊断结核分枝杆 菌的耐药性。分子药敏试验建立在基因扩增的基础上，从结核
6、分枝杆 菌分离株或预处理的临床标本中检出耐药基因突变。目前，主要的分 子生物学检测技术有实时荧光定量PCR技术、线性探针技术、熔解曲线技术、基因测序技术等。1 .实时荧光定量 PCR技术：通过自动监测整个PCR过程中荧光信号的积累，检测PCR扩增产物并通过标准曲线对未知模板进行定量分析。其具有灵敏度高、特异性 强、检测时间短、可重复性好等优点。目前，用于结核分枝杆菌耐药检测的有 Xpert MTB/RIF 、Truenat MTB-Rif Dx 和 MAX-MDR-TB 其中前两者以结核分枝杆菌rpoB基因上利福平耐药决定区（rifampinresistance-determining reg
7、ion，RRDR）为靶标进行扩增，以实现对结核分枝杆菌和利福平耐药的检测。Horne等纳入57项研究（共计8287例结核病患者)进行分析，结果表明Xpert MTB/RIF检测利福平耐药的合并灵敏度和特异度分别为96%和98% o 2020年WHO快速通告指出 Truenat MTB-Rif Dx的灵敏度达 93%，特异度达 95% ;校正准确检出率为 98.6%，对于RRTB突变位点的准确检出率，可涵盖 超过全球90%已知的利福平耐药机制相关突变。MAX-MDR-TB 是检测临床标本中结核分枝杆菌复合群并同时检测异烟肼和利福平耐药性 的新技术，与表型药敏试验相比，检测异烟肼和利福平耐药的灵敏
8、度/特异度分别为 58.3%/99.3% 和 100%/98.2%;与 GenoTypeMTBDRplus 相比，检测异烟肼和利福平耐药的灵敏度/特异度分别为100%/99.4% 和 100%/99.4% 。罗氏 cobas MTB-RIF/INH 是 WHO 2020年新推荐用于 DR-TB诊断的技术，通过核酸扩增来检测异烟肼 和利福平耐药基因的突变，该方法检测利福平和异烟肼的灵敏度/特异度分别为 88.4%/97.6% 和 76.6%/100%。2 .基于探针的药敏试验检测技术：分子线性探针测定法即耐药结核分枝杆菌基因分型技术(Ge no TypeMTBDR)，是基于DNA-DNA 杂交技
9、术的同时使用多个探针，针对常 见耐药突变位点进行检测，检测周期为57 h o目前，WHO推荐用于痰涂片阳性样本初步耐药筛查的线性探针包括GenoTypeMTBDRplus 、Nipro NTM+MDR-TB 和 GenoType MTBDRsl，前两者通过检测rpoB、katG和inhA启动子区域的突变来探测异烟肼和利福平的耐药性。 Ge no Type MTBDRsl通过检测gyrA、rrs和embB基因突变来检测乙胺丁醇、喹诺酮类药物和二线注射剂的耐药性。以 表型药敏试验和靶标测序为参考，对379株菌和644份痰标本进行耐药性检测，结果表明 GenoType MTBDRplus、Nipro
10、 NTM+MDR-TB对利福平耐药检测的灵敏度/特异度分别为90.3%98.2%/97.8%98.5% 和92%96.5%/97.5%98.5%，对异烟肼耐药检测的灵敏度/特异度分别为 89.1% 95.4%/98.8%99.4% 和 89.6%94.9%/97.6%100%。Gardee等的研究显示， 与表型药敏试验相比，Geno Type MTBDRsl vers ion 2.0对氟喹诺酮类和二线注射剂耐药检测的灵敏度分别为100%和89.2%，特异度分别为98.9%和98.5%PZA-TB n (PZA-LPA2)是日本 Nipro 公司推出的检测吡嗪酰胺耐药 的分子探针，以表型药敏试验
11、和基因测序为参考，在排除异质性耐药 的情况下，PZA-LPA2检测吡嗪酰胺耐药性的一致率高达94.3% 。分子线性探针测定法可用于快速诊断XDR-TB和MDR-TB ，然而由于抗结核药物的耐药分子机制尚未完全阐明，线性探针靶标仅限于常见 的耐药突变位点，且这种新方法检测部分药物耐药性的灵敏度较差， 加之设备昂贵，对实验室的条件要求较高，所以目前尚不能完全取代 传统的培养和药敏试验。3 探针熔解曲线技术：PCR和熔解曲线分析相探针熔解曲线技术是一种基于实时荧光定量 结合的新技术，通过分析特异性的探针与基因扩增产物的解链温度（Tm值）来判断待测基因是否发生突变，可以区分单个碱基的序列差 异。李春燕
12、等以表型药敏试验为金标准，对200份痰涂片阳性患者的痰标本采用探针熔解曲线法检测耐药性，在初治患者中检测异烟肼、 利福平耐药性的灵敏度和特异度分别为71.43%和96.77%、80%和97.92% ;在复治患者中两药的灵敏度和特异度分别为35%和 81.25%、82.35%和94.74%。曹志华等以表型药敏试验为金标准， 采用探针熔解曲线技术对153株临床分离株进行检测发现，对利福平和异烟肼耐药性检测的灵敏度分别达95.56%和90.57% 。 Xpert MTB/RIF Ultra 技术是Xpert MTB/RIF技术的改良版，以熔解曲线技术替代实时荧光定量PCR技术，Ultra较Xpert
13、的检测极限更低15.6集落形成单位（colony forming unit， CFU）/mL 比 112.6 CFU/mL，检测的灵敏度显著提高，同时Ultra 排除了 rpoB 基因Q513Q 和F514F的沉默突变，克服了 Xpert出现假阳性的部分限制。Zifodya等纳入5项研究（共计930例结核病患者），结果表明Ultra检测利福 平耐药的总灵敏度和特异度分别为94.9%和99.1%，Xpert检测利福平耐药的灵敏度和特异度分别为95.3% 和98.8%。Xpert MTB/XDR技术是美国赛沛公司最新推出的Gen eXpert 10色荧光技术，可同时扩增结核分枝杆菌的8个基因 和启
14、动子区，并使用松散分子信标 （sloppy molecular beacon ， SMB）探针分析解链温度 （Tm 值）以识别 异烟肼、氟喹诺酮类、乙硫异烟胺和二线注射剂耐药相关的突变，90min内获得结果。Cao等的研究结果显示，在100份结核分枝杆菌阳性痰标本与214株临床分离株中，以表型药敏试验为参考标准，检测耐药性的灵敏度和特异度如下：异烟肼为98.3%和95%，氟喹诺酮类为91.4% 和98.5%，二线注射剂为 70%98.1%和97%99.7%，乙 硫异烟胺为65.4%和97.3%。当以测序结果为参考标准时其灵敏度，异烟肼为99.7%，氟喹诺酮类为97.5%，二线注射剂为94.1%
15、100%， 乙硫异烟胺为 88.5% ;除了乙硫异烟胺的特异度为97.3%夕卜，其他药物的特异度均为 100%。该技术通过 SMB探针识别突变特异的解链温 度模式，可以区分异烟肼和氟喹诺酮类的低水平耐药和高水平耐药， 以及二线注射剂的交叉耐药与单耐药。该方法的检测极限与XpertMTB/RIF 相当。与表型药敏试验相比，探针熔解曲线检测技术在结核分枝杆菌耐药性 的快速检测方面有较高的阳性检测能力，同时更加简便、快捷。但需 要注意的是由于该方法检测的是碱基序列变化，所以对于一些碱基发 生突变而氨基酸不变的无义突变则无法识别，会造成假阳性结果。同 时该方法仅覆盖一些常见的突变位点，因此对于复治结核病患者耐药 诊断的灵敏度还有待提高。4 .其他新型耐药性检测技术：基因测序技术：基因测序是一种新型基因检测技术，通过对病原体 的基因序列进行测定分析，并与标准序列对比，以实现对结核分枝杆 菌及其耐药性的精准检测。有研究纳入7个国家共计7 094例结核病患者的临床分离株，以表型药敏试验作为参考，对一线和二线抗结核药物的耐药基因进行测序，结果表明对利福平、异烟肼、氟喹诺酮类、吡嗪酰胺、注射剂耐药性检测的灵敏度分别为91%、86%
