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1、细胞培养常见污染的判别及应对措施2011-01-02 10:19:04|分类：|标签：污染|字号大中小订阅一、避免细胞培养污染的措施：污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无 菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以 避免 的：1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液 枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒 精擦台面，紫外照20分！2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要
2、滴在瓶口上等等。3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养 基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污 染可能程度依次向外摆。二、常见的细胞培养污染：下面是几种细胞培养过程中常见的污染：1. 支原体污染：传说中的黑焦虫，长得暴快。24小时就满视野都是了。污染源大多数情况下是培养用血清
3、。图1支原体污染的光镜检测（圆圈所示，x10倍）图2支原体污染的光镜检测（x20倍）图3 支原体污染的荧光检测图4支原体污染的电镜检测（x30k，煎蛋状和其他形状）图5 支原体污染的电镜检测2. 念珠菌污染：似乎无处不在，而且顽固得很。长得暴快（12h就能在细胞上面密布）。培养液澄清。低倍显微镜下 像黑色的沙子铺在细胞上，高倍镜下呈树枝状或葡萄状。图6 念珠菌污染的光镜检测（低倍镜）图7 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图 8 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图 9 念珠菌污染的检测（革兰氏染色阳性）这么大面积的污染，你可以看看是不是操作上出了问题，要不然就是培养基的问题。既然已经污染 了，就全部
4、更换你的器皿。培养箱的水没有必要用无菌水，但最起码要是蒸馏水。3. 霉菌污染比较常见的一种污染，常常来源于污染的空气、水和器械。图 10 霉菌污染的光镜检测（低倍）图 11 霉菌污染的光镜检测（典型的霉菌污染，肉眼看到白色的团块或白点，镜下呈丝状。400 倍）图 12 霉菌污染的光镜检测（树枝状，高倍）图 13 霉菌污染的倒置显微镜检测（树枝状）4. 杆菌污染：培养基中加入抗生素可以减少此种污染，但也不是绝对的。图 14 杆菌污染的光镜检测（瑞氏染色，高倍）图 15 杆菌污染的光镜检测（瑞氏染色，低倍）细胞中的颗粒到底是怎么回事？ 我的细胞总有颗粒，开始是细胞中有，后来细胞之间也好像有许多颗粒
5、。好像是细胞碎片一样。是什么东 西啊？是支原体污染吗？这可是我刚买回来的细胞啊!我们实验室也有这种情况，是不是黑的小碎片，有人说是细胞代谢产物，后来拿到高倍镜下看还会动，就 怀疑是污染了，也想问问大家到底是什么是黑色的小碎片。我没注意到它会动，只是觉得不像是活的微生物。我觉得是由于某种污染或外界因素导 致的细胞状态变差，裂解出的东西。但是，是什么东西不清楚。的确很常见 在以前帖子见到说是“黑焦虫”。长时间培养的很容易出现，我根据自己的经验估计是一种污染，因为随着 黑点增多，本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现，我怀疑 有好多细胞系本身就是污染的。不过增加换
6、液次数的情况下，好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题，可以有条件换进口血清试试，或者离心一下也可能能 解决问题。那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊？有谁知道？我培养的细胞也出现过此中问题，放到高倍镜下看时有东西在动，但培养液不混浊，估计不是细菌污染， 可能是血清问题，是支原体污染。我培养的细胞也出现过这样的问题，我个人认为是一种支原体污染。国产血清是罪魁祸首，因为只要将细 胞饥饿一下，不超过 24 小时，这种东西就会疯长我培养的细胞也有出现这中情况。但是并不影响细胞生长。应该不是支原体污染最近，我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西，尽管我用的
7、是GIBCO的FBS，后来，每天换液之前 洗几遍后，就慢慢变少，现在没了细胞培养的细菌污染我们新建的细胞室。每周都会做清洁，用 0。2%新洁尔灭消毒，照紫外。实验前也会照至少30 分钟。培 养基中加青霉素，链霉素。可是培养细胞时还是常有细菌污染，有时甚至分析不出原因。用培养瓶还好一 点，用多孔板或平皿就更凄惨。我养的是哺乳动物细胞，不知各位有什么好的方法避免污染！谢谢！很可能是超净台无效了，或者培养基？ 其实严格操作箱污染都难我们是新的超净台，不可能失效。而且用同一瓶培养基，一瓶传两瓶，原始的一瓶污染， 新传的很好。所以我分析不出原因呀那么假如把原始的那瓶换新瓶养可以么？都污染了，我仍还来不及
8、，那还敢换新瓶染菌有很多原因，因为整个细胞操作过程均要求无菌，所以看看操作是否规范，例如戴手套等。多半是环境因素，做点平板，操作时放在几个地方，培养后看看长菌情况。消毒用新洁尔灭好象不是太有 用。人是最大的污染源，不知你做好手部的消毒工作以及戴口罩没有，其实，只要你操作的好，严格在靠近火 的附近操作，污染的几率是很小的。从你的描述中可以看出培养基应该没有问题，新的一瓶很好，老的一 瓶污染，只有操作不当引起的，还需要加强练手。求助！关于细胞培养中的真菌污染！感激！ 先谢谢大家的帮助！现在细胞培养基里出现了很多白色和黑色的小点，有好长的时间了！细胞的形态看起 来不太好，但是有些细胞也长的很好，如成
9、纤维细胞，但是内皮细胞就差很多！加大量的抗生素没有效果！ 不知道是不是真菌污染，怎么鉴别！因为培养了很长时间都没有出现真菌的菌丝，所以不能肯定是真菌！ 那些白色的小圆点有点象白色链球菌或链珠菌，但是不能确定！怎么样才能判断确定，改用什么办法解决！ 谢谢大家的帮助！杀灭真菌听说用两性霉素，但从没试过。真菌污染是件很麻烦的事，可能重新复苏细胞是最好的办法。同 时该注意如何防止污染。我觉得如果是真菌污染，培养基会浑浊，是肉眼可见的浑浊。在这种情况下最好赶紧将该瓶细胞扔掉，免 得引起培养箱中的大规摸污染。在显微镜下，真菌是成念珠状的，这时细胞界限不清。这可能是不规范操 作引起的，安全起见还是将细胞室全
10、面打扫一下，用新洁尔灭擦，紫外照！谢谢大家的帮助，因为实验室以前从来就没有这样的污染，所以大家也没有经验！现在就是不能确定是不 是污染。我不可能把实验室所有的细胞都扔掉，因为有好多人都在一起养不同类型的细胞！现在确实是问 题，培养基也没有浑浊，操作的时候已经十二分的小心了！我想问一下，你看到的那些白色或黑色的圆点是在低倍还是高倍显微镜下？若培养基不混浊，可能真的是 细胞状态太差，没有贴壁还缩成球状。难道你们实验室所有细胞都用一瓶培养基？只要将污染的扔掉就行， 没必要都扔掉！两性霉素！ sigma在华美有分装！但是浓度很小，关键还是环境问题！黑白圆点在100 倍显微镜下有多大，是不是酵母菌小黑点
11、和小白点是在 200 倍的显微镜下观察所见，大小可能是细胞核的 1/5 到 1/4 左右！细胞状态不好是 因为跟以前培养的细胞来比较所得，细胞能贴壁，能生长，但是没有以前的那么快，而且形态看的也不好！ 另外问一下sleevexz,酵母菌是什么样的，怎么鉴别！还有一个问题就是，实验室用的双抗是从 Gibco 公司买过来的直接使用的液体，具体规格是 100ml 一瓶，Pelicillin-Streptomycin 起，50倍的，要求储存在一20 C,但是有效期只到2002年9月，现在都已经差 不多过期半年了,但是实验室的老师都说没有问题,可以用,现在大家就都是一直用这样的抗生素在！你 们说会不会是
12、抗生素的问题的！养细胞经常无缘无辜的染菌？烦烦烦！我是一个新手,但已养细胞近半年,最近一段时间经常染菌, 有时是培养基,有时连原因都找不到,在实验中我也非常小心,但结果总让我伤心。现在都有点神经质了, 请各位指点你这个问题说大不大,说小也不小。说不大呢,七个字就可以回答你：严格按照无菌要求。说不小呢,这 无菌要求的话匣子一打开太大。还是简要吧：1.将试验用品放入超净工作台用紫外线照射30分钟；2. 照 射30分钟后,进入缓冲间,换灭菌的无菌衣,换专用拖鞋；3.手部用5的洁尔灭浸泡2分钟,进入洁净 区后,用 75的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩；5.操作时尽量靠近火焰；6.装培养基的
13、瓶 子等不要直接口向上,用一个架子斜放,瓶口朝向火焰；7.标准操作,不要让无菌吸管到处碰来碰去；8. 中途出入无菌室,再次操作时,一定要再次用 75的酒精棉球消毒。一下也想不了那么多,具体的你再问吧。最好把你怎么操作的过程描述一遍,我们就好针对性的指出错误 了。建议你把细胞室,好好清理一下,污染是这样的,出现一次就比较麻烦,千万别急。还有,你们的紫 外灯没有问题吧？非常感谢楼上的回信,在操作中我也严格按照无菌要求去做,因为操作台是公用的,而其它同学很少染菌, 我想主要问题应在我身上,但是又找不到主要原因。我一般是这样操作的：紫外照后,用酒精棉檫拭手部 开始操作,基本步骤是吸培养液到方瓶,再在方
14、瓶中吹打混合,按比例传代,有时吸管头部碰在培养瓶口, 有时吸管口棉花塞的太紧或太松不好用,有时原因都找不到,请各位指点。戴手套试试巴最好是涂片看看是什么菌？注意操作,吸管碰别处立即更换。污染是常有的事,也不必太给自己压力,熟 能生巧。你的滴管吸管进培养液瓶和细胞培养瓶前要在酒精灯上仔细烤一下,滴管不要反复用。其实无菌操作第一 重要的就是你的超净台是不是还能用,滤网要及时清洗的。其次就是瓶口、滴管、移液器操作是过火的是 否正确。还有一点很重要,手一定不能在任何瓶口上方经过！从你操作的步骤来看,你的细胞应该是很好操作的。没看到你要用消化液,这就减少了污染的机会。你用 的吸管是自己做的吗？经常练练,
15、熟能生巧,时间长了,你就知道如何控制所塞的棉花量了。（用牙签或 12 号针头等工具来塞比较方便,塞完后用火将露出的部分烧掉再灭菌,这样就不会在上吸耳球的过程中, 出现将棉花弄掉的情况）,另外,你要勤剪指甲,不要戴首饰,吸管一周灭一次菌,不要没用完老用。操作是导致污染的最主要原因 根据本人的经验,操作是导致细菌污染的最主要原因。 本人以前曾经在一个相当严格的实验室工作过,那里的细胞室的要求是按照外科手术室要求的,更衣,换 鞋,洗手,酒精擦手,戴口罩、帽子,所有培养液中加双抗,所有细胞操作器械专用；每天紫外灯照射40 分钟后才允许进入。但是,就是这样的条件,操作不好,一样要污染。现在本人工作的实验
16、室要求比那个实验室差的天远地远,但是只要操作仔细了,一样可以把最难养的细胞 养好。本人曾经参观过一些名人进行细胞操作,也就是换上拖鞋,连工作服都不换就进细胞室,细胞一样 没有问题。所以，最主要的是：工作服，尤其是袖口，消毒情况如何，袖口是否能够扎紧。如果不能保证， 不如索性把袖口挽起来，把手臂用酒精擦一遍（其实我本人连擦都懒得擦，一样没事）。操作时，滴管两 头都要烧。还有一点很重要，就是滴管头在加液体的时候，不要深入瓶口太多。在倒培养液的时候，可以 拿起培养瓶直接倒，但是注意要倒干净，瓶口沾的最后一滴液体千万不可回流倒瓶内。还有一些基本的问 题，比如瓶口要多烧一会，怀疑滴管有污染就一定要换。一旦细胞出现污染的迹象了，就一定要扔掉。如 果实在想挽救，可以用一些高档抗生素（
