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1、11供应材料。小麦种子；主要试剂：0.1%HgCl , TTC, 3%磺基水杨酸（SSA）, 2冰乙酸，茚三酮,PBS（pH=7.8），0.6%TBA（用 0.6% TCA 配制），PBS （pH=6.8, 内含 1mMHA），0.1%Ti（SO ）用 20%（v/v） H SO 配制，PBS, （pH=5. & 内含 0.4 2 2 41 mmol/ LEDTA, 1%PVP）, POD 反应混合液（10 mmol/L 愈创木酚，5 mmol/L H O ,22 用PBS溶解），PPO反应混合液（20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）5%三氯乙 酸，PBS （pH=7.7），4 mM D
2、TNB 用 0.1M pH=6.8PBS 现配）。主要仪器：分光光 度仪，离心机，试管，微量加样器，研钵等。1.21 Pro 脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具 有很高的水势。脯氨酸的疏水端可和蛋白质结合，亲水端可与水分子结合，蛋白 质可借助脯氨酸束缚更多的水，从而防止渗透胁迫条件下蛋白质的脱水变性。因 此脯氨酸在植物的渗透调节中起重要作用，而且即使在含水量很低的细胞内，脯 氨酸溶液仍能提供足够的自由水，以维持正常的生命活动。正常情况下，植物体 内脯氨酸含量并不高，但遭受干旱等胁迫时体内的脯氨酸含量明显增加，它在一 定程度上反映植物受环境干旱胁迫的情况，以及植物对水分和
3、盐分胁迫的忍耐及 抵抗能力。1.22 MDA 植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙 二醛（MDA ）是膜脂过氧化的最终分解产物，从膜上产生的位置释放出后，与蛋 白质、核酸起反应修饰其特征；使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合 成。MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害，它在一定程度上也反映了植物 受环境干旱胁迫的情况。1.23抗氧化酶植物体内存在着一套负责清除活性氧所产生的抗氧化系统，在 植物正常生长情况下，它使活性氧的产生和清除处于动态平衡状态，在逆境诸如 干旱胁迫下，这种平衡被打破。这种变化可通过分光光度器测定。1.24 GSH还原型的GSH是植物细胞中重要的
4、抗氧化剂之一，其可通过膜蛋白 巯基与二硫键化合物结合的比例，对细胞膜起保护作用。其含量的变化，一定程 度上反映了植物受干旱胁迫的情况。1.25 HO过氧化氢是植物代谢中产生的一种产物，其积累对细胞具有氧化破22 坏作用，在实验中，可根据其值的变化，来了解组织的破坏程度。因此，过氧化 氢的含量也是植物逆境的一项指标。1.3实验方法1.31 Pro的提取。分别取0.1 g实验组（为干旱处理5天）和对照组（不做 干旱处理）的胚芽鞘置于研钵中，加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英 砂充分研磨，再用2 mL 3% SSA洗研钵，置于离心机中，在5000 rpm下离心10 min，取上清液，定
5、容至5 mL。测定：取上清液各2 mL，分别加入2 mL冰乙 酸和2 mL茚三酮试剂再煮沸15 min，冷却后，5000 rpm离心10 min，分别测 定A 。1.32 MDA提取。分别取0.1 g实验组和对照组（与1.32做相同处理）置于研 钵中，加入3 mL 50mM PBS （pH=7.8）和少许石英砂充分研磨，再用2 mL PBS洗 研钵，置与离心机中，在5000 rpm下离心10 min，取上清液，定容至5 mL。 测定：分别取上清液各2 mL，加入0.6%TBA （用0.6% TCA配制）2 mL,煮沸 12 min，冷却后，5000 rpm离心10 min，分别测定0D 和0D
6、。4505321.33抗氧化酶的提取。分别取0.1 g实验组和对照组（同1.32做相同处理）置于研钵中，加入3 mL 50 mM PBS （pH=6.8内含ImM HA）和少许石英砂，充分 研磨，再用2 mL PBS洗研钵，置于离心机中，在5000 rpm下离心10 min，取 上清液，定容至5 mL。测定：POD测定；取POD反应混合液（10 mmol/L愈创 木酚，5 mmol/L HO,用PBS溶解）3.00 ml，加入酶液（提取液）100 ml （空白22调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应3 min时的A 。PPO测定：取 470PPO反应混合液（20 mmol/L邻苯二酚，
7、用PBS溶解）2.8 ml，加入酶液（提取 液）0.2 ml （空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应2 min时的A 。4101.34 GSH的提取。分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘（同1.32做相同处 理）置于研钵中，加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂，充分研磨，用2 mL 5% TCA洗研钵置于离心机中，在5000 rpm下离心10 min，取上清液定容至 5 mL。测定：上清液各1 mL， 分别加入1 mL0.1M PBS （pH=7.7）和0.5 mL 4 mM DTNB 用 0.1M pH6.8PBS现配，空白用此PBS代替），25 C5 min，分别
8、测定 A。4121. 35 HO提取。分别取0.1g实验组和对照组，加入3 mL 50 mM PBS （pH=6.8, 22内含1mM HA）和少许石英砂充分研磨，用2 mL PBS洗研钵，5000 rpm离心10 min ， 上清液定容至5 mL。测定:分别取上清液各3mL -加入0. 1%Ti（SO）用20%（v/v） HSO配制1 mL，4 224摇匀f。5000 rpm 离心 10 min ， OD。4102结果与分析2.1 Pro表一 Pro正常组和实验组的A和Pro con tent正常5201干旱胁迫A =0.117520Pro content =5.42(mol.g-1FW)A
9、 =2.935520Pro con tent =135.88( mol.g-1FW)AV以上通过Pro content =X V显X 总(卩moLg-1FW)而处理得e x L x W 业VZ用由上表可知，干旱胁迫下，脯氨酸的量是正常值的25倍，由此可以得到，干 旱胁迫会造成脯氨酸的积累。但是，植物合成、累积及代谢是一个受非生物胁迫 的一个过程，因此，脯氨酸的积累可能是生物受胁迫的一个信号。当植物处于干 旱条件下时，为了保护植物对干旱逆境的反应，在干旱胁迫下，脯氨酸的质量分 数会急剧上升。而脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，这表明它具有易于水合的趋势 或具有较强的水合能力。它的增加可能是植物对干旱胁
10、迫的一种保护性反应。2.2 MDA表二 正常组和实验组的A、A和可溶性糖及MDA的浓度。4505321正常干旱胁迫A =0.075450A =1.475450r =0.047532r =0.418532可溶性糖浓度=0.88 mmol/L可溶性糖浓度=17.27 mmol/LMDA 浓度=0.26umol/LMDA 浓度=1.87 umol/L以上实验结果是通过以下方程处理而得。OD帧=C)X 85.40口鸡=G X 7.4 + 155 000 X C2求解方稈得Ci/ (mmol/L =11. 71C2 / (pmol/L)=氐 45 ()1入比一6 56 OD伽 式中，G为可溶性糖的浓度孑
11、G为MDA的浓度。由上表可知，干旱胁迫下，丙二醛的浓度是正常情况下得7倍，因此，在干旱胁迫也会造成MDA的积累，MDA的最大特点是对细胞质膜和细胞中的许多物质均有很强的破坏作用，因此，植物组织可能是通过产生并积累MDA等对细胞有害物质，进而破坏植物组织，使植物在逆境坏境中生长不好。POD activities =A470 xVBx 总 xWxt 显町(moLg-iFWmin-i)PPO activities =A410x 总O.OlxWxt V用(U. g-iFW)2.3抗氧化酶表三 正常组和实验PPO和POD不同时间所测得值PP0和POD activities正常干旱胁迫PPO A =0.1
12、14 (30s) A =0.116410410(1min30s) A =0.118 (2min)410PPO A =0.07 ( 30s)A =0.073410410(1min30s)A =0.075POD A = (30s) A = 1.419 (1min)410470POD A =0.385 ( 30s) A =0.783410410(1min)PPO act ivi ties = 50(U.g-1FW)PODactivities=(mol.g-1FWmin-1)PPO ac tivi ties = 75(U.g-1FW)PODactivities=44.89( mol.g-1FWmin-
13、1)以上数据是通过以下方程计算而得由上表可知，在干旱胁迫下，也会造成PPO和POD的积累。抗氧化酶的主要作 用是消除ROS对植物的伤害，使抗氧化酶与ROS处于一个动态平衡。在干旱胁迫 下，抗氧化酶总体增加，说明，这一个动态平衡体系被打破，使植物不能消除 ROS对自身的伤害，因而，逆境下植物生长不好。2.4 GSH表四 正常组和实验组GSH的A值和GSH content412正常干旱胁迫A =0.071412 GSH con ten t二 0.91( mol.g-1FW)A =0.166412 GSH con ten t=2.14( mol.g-1FW)GSH con tent是通过以下公式计算
14、而得GSH content =x L X W用由上表可知，逆境中，GSH含量也明显增加，在干旱胁迫下也一定程度上造 成了 GSH的积累。GSH是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，如与自由基、重 金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质。GSH含量的增加，一 定程度上，反应了植物在逆境中，也能合成一些产物，增加其抗逆性，以便植物 能在逆境中生长。2.5 HO表五 正常组和实验组H0的A和HO content2 2 410 2 2正常干旱胁迫A =0.087A =0.532H O con ten t=20.71( mol.giFW)H O con ten t=126.67( mol.giFW)以上H O con tent是通过以下公式计算而得:22AVH2O2 content =& xLXW X显X(ymol.gFW)由上表可知，干旱胁迫下，也会造成过氧化氢的积累。过氧化氢是体内重要的 代谢产物，其积累对细胞具有氧化破坏作用，其含量的高低，一定程度上反映了 CAT活性的高低。因此，在干旱胁迫下，有可能是CAT酶活性降低，造成过氧化 氢在植物体内的积累，从而破坏了细胞的氧化作用，使植物不利于在逆境中生长。
