白细胞的检测方法

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1、第四章 白细胞检验的基本方法 第一节 白细胞功能的检验一、墨汁吞噬试验【目的】 掌握墨汁吞噬试验的原理、方法、注意事项和临床意义。【实验原理】墨汁吞噬试验(ink phagocytosis test)是依据血液中的中性粒细胞及单核细胞 对细菌、异物等具有吞噬作用，在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，经37C温 育4h,涂片染色后，在显微镜下观察吞噬细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指 数，从而协助急性白血病的诊断与鉴别。【材料】1. 器材 试管、移液管、微量移液器、载玻片、37C水浴箱、显微镜等。2试剂(1)肝素：配成 6U/ml 水溶液。(2)制备墨汁：于普通砚台上加生理盐水5m

2、l,以优质中国块墨或印度墨，以100r/min 研磨3min。所得墨汁经普通滤纸过滤3次备用。( 3)瑞氏染液等。【方法步骤】1. 取小试管1支，加肝素20p l,加外周血100p l,混匀。2. 加入过滤墨汁10p l,混匀，加塞。3. 置37C温育4h。4. 取温育后样本，推制成血涂片，干燥后，瑞氏染色。5. 油镜下观察计数幼稚细胞或中性成熟粒细胞100个；计数单核细胞20个。6. 判断结果 根据细胞吞噬墨粒多少及大小，可定为下列程度： 阴性：细胞内未见吞噬墨粒。阳性：(+)细胞内吞噬有小墨粒15个。(+) 细胞内吞噬有大小不等墨粒10个左右。(+) 细胞内吞噬有大墨粒 10 个左右，小墨

3、粒较多。(+) 细胞内吞噬有多数大颗墨粒，并有块状、球状，小墨粒很多，但细胞核 清楚。7. 计算吞噬率及吞噬指数 吞噬率() = X100% 吞噬指数=【注意事项】 肝素剂量对白细胞的吞噬功能有影响，肝素用量过大，细胞形态异常，吞噬 率和吞噬指数降低；肝素用量过小，影响抗凝。以每100|J l血用0.3U肝素为最适宜。【参考范围】成熟中性粒细胞吞噬率5989%，吞噬指数66186； 成熟单核细胞吞噬率90100%，吞噬指数227399。【临床意义】 临床上可利用该试验了解吞噬细胞的吞噬功能，对白血病的诊断和分型 有一定参考价值。粒细胞仅成熟阶段才具有吞噬功能，单核细胞幼稚阶段和成熟阶段均具有

4、吞噬能力。AML-M5a为弱阳性，M5b吞噬指数明显增高。AML-M2、ALL和AML-M3吞 噬试验均为阴性，AML-M4呈阳性反应。CML的成熟粒细胞吞噬能力明显降低。二、白细胞吞噬功能试验【目的】 掌握白细胞吞噬功能试验的原理、方法、注意事项和临床意义。【实验原理】白细胞吞噬功能试验(leukophagocytic function test),是将待测的白细胞与葡 萄球菌混合，37C温育一定时间后，细菌可被中性粒细胞吞噬，涂片染色后，在显微镜下观 察中性粒细胞吞噬细菌的情况，计数吞噬细菌的白细胞数以及被吞噬的细菌总数，计算吞噬 率和吞噬指数，据此反映中性粒细胞的吞噬功能。【材料】1器材

5、 接种环、小试管、微量细胞培养板、水浴箱、载玻片、显微镜等。2试剂(1)制备菌液:取在琼脂斜面上或平板上培养24h的白色葡萄球菌菌苔，用PBS (0.015mol/L pH6.4)洗2次，沸水浴1520min灭菌。将灭活菌液混悬于20% FCS-RPMI1640培养液中， 用比浊法调整细胞浓度至5X1010/L，置4C备用。( 2)100U/ml 肝素、甲醇、吉姆萨染液等。【方法步骤】1. 于微量细胞培养板孔内(或小试管内)加100U/ml肝素1 滴,无菌采集末梢血3 滴,与孔内抗凝剂立即混匀。2. 向孔内(或小试管内)加白色葡萄球菌悬液3 滴，混匀。3. 置有盖湿盒内，37C温育30min,

6、每10min轻摇一次。4. 用滴管取1滴培养液，推成薄片，甲醇固定，吉姆萨染色、干燥。5. 镜检计数 油镜下观察计数200个中性粒细胞，记录吞噬细菌的细胞数，以及各个 细胞吞噬的细菌总数，按下式计算吞噬率和吞噬指数。吞噬率(%)= X100%吞噬指数=【注意事项】1. 所用器材要清洁。2. 抗凝剂用量应适当，过高会抑制吞噬功能，过低则易出现血液凝固。3. 要严格掌握吞噬的时间和条件。细菌与细胞比例以1 ： 110为宜。4. 涂片要薄，以便尽量减少因细菌重叠在细胞上而误以为吞噬的错误。5. 计数时应取载玻片前、中、后三段计数，以提高准确性。6. 本试验采用光学显微镜检查，分辨率不够高，有时难以准

7、确计数吞入的细菌颗粒，应认 真识别。7. 应根据各室的具体方法建立本室参考范围，以便客观地判定被测标本中性粒细胞的吞噬 能力。【参考范围】吞噬率:健康人为 61.464.2%。吞噬指数:健康人为1.011.11。【临床意义】 白细胞吞噬功能是其最重要的生物功能之一，本试验可作为判断机体白细胞 功能状态，诊断白细胞本身所致疾病的参考。1. 吞噬率和吞噬指数增高，反映中性粒细胞吞噬异物功能的增强，常见于细菌性感染。2. 吞噬率和吞噬指数降低，见于机体免疫功能低下；营养、代谢、肿瘤等因素致白细胞分 化不良或不成熟，如粒细胞性白血病，多发性骨髓瘤等；机体存在明显抑制白细胞的因素， 如免疫抑制剂、抗白细

8、胞抗体等。三、血清溶菌酶活性试验【目的】 掌握血清溶菌酶活性试验的原理、方法、注意事项和临床意义。【实验原理】血清溶菌酶活性试验(serum lysozyme activity test)，是利用溶菌酶能水解革 兰氏阳性球菌细胞壁的乙酰氨基多糖成分，使细胞壁裂解，用对溶菌酶较敏感的微球菌悬液 为作用底物，根据微球菌的溶解程度来检测血清或尿中溶菌酶的活性。(一)平板打孔法【材料】1. 器材 接种环、毛细滴管、无菌打孔器(孔径5mm左右)、水浴箱、测量尺等。 2试剂(1) 等渗缓冲液(pH 6.4)： A液：磷酸二氢钾9.07g,氯化钠5.0g，溶于1 000ml蒸馏水中。 B液：磷酸氢二钠(Na

9、2HPO412H2O)23.87g，氯化钠5.0g，蒸馏水加至1000ml。A液、B 液以10 : 3比例混合，调至pH6.4。(2) 制备溶壁微球菌：制备营养琼脂斜面培养基：取琼脂4.3g，加牛肉浸膏1.0g，蒸 馏水100ml，浸10min后煮沸，使其完全溶解，倒入若干大试管，加塞，高压消毒15min, 取倾向位室温冷却，置4C冰箱保存，备用；接种：溶壁微球菌在使用前于琼脂斜面培 养基上传代一次，试验前按常规接种微球菌于斜面，置37C培养2448h,即可长出黄色菌 落；制备细菌悬液：用无菌蒸馏水洗下菌苔，2000r/min离心30min，弃上清。再加蒸馏 水轻轻混匀，2000r/min离心

10、30min,弃上清，称沉淀物湿重，用无菌蒸馏水配成100g/L的 浓菌液(菌液应在临用前配制，不宜存放过久)，7080C加热灭菌，备用。(3) 1% 琼脂：称琼脂粉 1g,加入 1/15mol/L pH 6.4 PBS 100ml。(4) 溶菌酶标准液：取溶菌酶标准品，用1/15mol/L pH 6.4 PBS制成5、25、100mg/L稀释 液。( 5)被检血清。【方法步骤】1. 制备溶壁微球菌琼脂平板取已配制好的菌液1ml,加到5060C已溶化的1%琼脂中， 摇匀，倾注平板(直径79cm平板加1%琼脂15ml),待冷凝。2. 打孔 用打孔器在溶壁微球菌琼脂平板上打孔，孔间距1820mm,用

11、牙签挑去孔内琼脂。 3加样 用毛细滴管吸取血清，加入琼脂孔内。同时在另一孔内加满溶菌酶标准液作为阳 性对照。4. 温育置2530C温育1824h，观察结果。5. 制备标准曲线 在每批测定同时，将各种浓度的溶菌酶标准液加入小孔中，同上法测定 溶菌环的直径。在半对数纸上，以溶菌酶浓度为纵坐标(对数坐标)，溶菌环直径为横坐标 绘制标准曲线。从曲线上查出每毫升待检品所含溶菌酶的微克数。6. 判断结果 加血清孔和溶菌酶标准液孔周围的溶壁微球菌被溶解，可见圆形透亮区，即 溶菌环。溶菌环的直径大小与溶菌酶的含量成正比。【注意事项】 测量标准品与待检样品溶菌现象的间隔时间应尽量缩短，最好能在同一块板上备有标准

12、品的 对照，以便比较。(二)比浊法【材料】1. 器材 接种环、试管、 721 型分光光度计、水浴箱、微量移液器等。2. 试剂(1)等渗缓冲液(pH 6.4)：同平板打孔法(2)制备溶壁微球菌:同平板打孔法。将制备的菌液过滤，取上清液于分光光度计600nm 波长处，以缓冲液调零，调节菌液浓度使其光密度为0.4，冰箱保存。(3)制备溶菌酶标准液：称取干燥溶菌酶2mg,用pH6.4的等渗缓冲液溶解，其酶浓 度为lmg/ml(1000|J g/ml),储存液置冰箱保存，备用。溶菌酶应用液则取0.1ml溶菌酶储存 液加4.9ml缓冲液，稀释50倍，其酶含量为20p g/ml。【方法步骤】1.将菌液置37

13、C水浴中预温2min。2抽取患者血液，分离血清，按表 4-1 进行操作。表 4-1 溶菌酶测定步骤加入物标准管菌液对照管测定管123456微球菌液(m1)3.03.03.03.03.03.0缓冲液(p 1)20406080100一溶菌酶应用液(P 1)80604020一一(每隔 1min 加入)血清1)100混匀，每管于37C水浴中准确温育10min，取出即加反应终止液5mol/L NaOH(ml)0.050.050.050.050.050.053. 以缓冲液调零，600nm波长处比浊，检测各管的光密度。4计算 -5制备标准曲线 以测得各标准管的光密度为纵坐标，各标准管所含标准酶浓度为横坐标

14、(第1管含酶16p g/ml,依次为12p g/ml， 8p g/ml，4p g/ml)，菌液对照管的光密度为零 点，在坐标纸上画一曲线。6根据标准曲线查出被测血清样品所含溶菌酶的量。注意事项】1菌液4C保存比较稳定。溶菌酶标准液以高浓度4C保存为佳。2每批溶菌酶样品的测定须同时作标准管与菌液对照管的测定。3. 血清标本4C保存10d,酶活性基本不变。4该法可同时用于测定尿中的溶菌酶活性，但要收集24h尿量，并加防腐剂，所得结果乘 以尿量。5.该法只适用于测定较窄浓度范围的溶菌酶，因此，测定前应先将待检样品的浓度作适当 调整，使之适用于限定的测定范围。6. 细胞溶菌酶测定 血和离心后的菌液各

15、1 滴，混合后制成涂片，置含湿纱布玻皿内， 于37C温育30min,干燥后瑞氏染色、镜检。细胞周围菌少，变细、变淡，并可见透明环 为阳性。【参考范围】 血清515mg/L；尿02mg/L。【临床意义】 人体血清中的溶菌酶，主要来自血中的单核细胞和粒细胞，其中以单核细胞 含量最多。在中性粒细胞中，从中幼粒到成熟粒细胞，其溶菌酶的含量可随细胞的成熟程度 而增高。在嗜酸性粒细胞，除中幼阶段外，其余均无此酶。淋巴细胞中含量极低。血清和血 浆中的溶菌酶大部分是由破碎的白细胞所释放。白血病患者血清溶菌酶含量的变化很大，与 其细胞类型有密切关系。1增高 主要见于急性髓细胞白血病：AML-M5其血清溶菌酶含量明显增高，因外 周血中成熟单核细胞增多导致溶菌酶释放增多所致，且增高程度与成熟单核细胞多少有关。 尿溶菌酶含量也增高，故尿溶菌酶阴性可排除AML-M5的诊断。AML-M4其血清溶菌酶 含量也明显增高，其增高程度与白细胞总数有关。在治疗前其含量明显高，表示细胞分化程 度较好，预后亦较好。急性粒细胞白血病，其血清溶菌酶的含量可正常或增