时间相关单光子计数法测量荧光寿命

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1、时间相关单光子计数法测量荧光寿命(一) 实验目的与要求目的：1、了解时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理和方法2、学习时间相关单光子计数荧光光度计的使用方法 要求：1、掌握时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理；2、理解荧光寿命测量在物质定性及定量分析中的应用；3、了解时间分辨荧光光光度计的基本组成，各部件的作用；4、学习利用Origin软件处理实验数据。(二) 实验原理1时间相关单光子计数器工作原理TCSPC (Time-Correlated Single Photon Counting) 是目前主要应用的荧光寿命 测定技术。1975年由PTI(Photon Technology Inte

2、rnational)公司首先商品化，此外， Edinburgh Instruments、IBH、HORIBA 等公司也在生产基于TCSPC的时间分辨荧 光光谱仪。TCSPC的工作原理如图1所示，光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生 电信号，该信号通过恒分信号甄别器1启动时辐转换器工作，时幅转换器产生一个 随时间线性增长的电压信号。另外，光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池, 样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终止光电倍增管，由此产生的电信号经 由恒分信号甄别器2到达时幅转换器并使其停止工作。这时时幅转换器根据累积电 压输出一个数字信号并在多道分析仪(Multichannel Anal

3、yzer)的相应时间通道计入 一个信号，表明检测到寿命为该时间的一个光子。几十万次重复以后，不同的时间 通道累积下来的光子数目不同。以光子数对时间作图可得到如图2所示直方图，此图 经过平滑处理得到荧光衰减曲线。图1 TCSPC的工作原理简图巴电倍培诗检测到的光二费njnu图2时间相关单光子计数2荧光寿命及其含义假定一个无限窄的脉冲光3函数)激发n0个荧光分子到其激发态,处于激发态的 分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为r和knr，则 激发态衰减速率可表示为如 = -(r + k )n(t)dtnr其中n(t)表示时间t时激发态分子的数目，由此可得到激发态物种的单指数衰

4、减方 程。荧光寿命定义为衰减总速率的倒数：t = (r + k )-1nr 7荧光强度正比于衰减的激发态分子数，因此可将上式改写为:。I (t) = I0 exp ( - t/r)其中I0是时间为零时的荧光强度，r为荧光寿命。也就是说荧光强度衰减到初始强 度的1/e时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿命。实际上用荧光 强度的对数对时间作图，直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。荧光寿命也可以理解 为荧光物种在激发态的统计平均停留时间。事实上当荧光物质被激发后有些激发态 分子立即返回基态，有的甚至可以延迟到5倍于荧光寿命时才返回基态，这样就形成 了实验测定的荧光强度衰减曲线。3荧光寿命测定

5、中的数据处理由于实际体系的复杂性，荧光衰减往往要用多指数或非指数衰减方程描 述:I (t)=工 a exp( -t /t )ii式中为第i项的指前因子。衰减方程的复杂性反映了体系中荧光物种的多样性或 存在状态的复杂性。当所测量的荧光寿命较短时，实验数据就和光源的脉冲宽度， 光电倍增管及电子学电路的响应时间有着密切的关系。为了去掉仪器响应对测量结 果的影响，需要解下面的积分方程：N(t )二 L(t ) I (t ) kkk样品的实测荧光衰减曲线N(tk),实际上为L(tk)与脉冲响应函数I(t)的卷积，即利用 解卷积的办法有可能得到脉冲响应函数I (t),进而求得描述样品荧光衰减本质的荧 光寿

6、命(T等有关参量。实际工作中一般以胶体SiO2 (商品名Ludox)为虚拟样品进 行测定,仪器响应函数表明了仪器能够测定的最短荧光寿命。(三) 仪器与样品仪器：LifeSpecII荧光光度计样品：甲基橙染料溶液(四) 实验步骤与内容1、实验仪器的准备：打开C01,主机和F900电源；打开计算机，双击桌面上 F900图标进入工作站；光度计开始初始化，并进行自检；当荧光光度计自检结束， 处read y状态时，则可以开始测量；2、点 击进入 Signal Rate 设置 窗口，先将 Excitation Wavelength 和 Emission Wavelength处的A九均设置为0.01nm，按

7、回车键(Enter)或者点击Appl y确认；3、打开样品室的盖子，将待测样品放置于样品架上，注意放置样品的位置，使 激发光能落在样品上并且样品发出的光能进入探测器，然后盖好；4 、 在 Signal Rate 设 置 窗 口 内 输 入 相 应 的 Excitation Wavelength 和 Em1 Wavelength值，逐渐加大A九，并调节Iris Setting使Em1获得一个合适的Signal Rate (注 意：在设置后需要按下回车或者Apply按钮设置才真正生效，Em1的Signal Rate千万 不要超过106)；5、点击九按钮，选择Emission Scan，进入设置窗口

8、，在Emission Scan Parameters 内设置波长扫描范围、扫描间隔(step)、停留时间(Dwell Time)和扫描次数(Number of Scans)，设置完毕后点击Start即开始测量，得到发射光谱(荧光光谱)；6、点击p按钮，选择Manual Lifetime，进入设置菜单，在Excitation栏内设置好 激发波长和Light Source，在Emission 1栏内设置好发射波长和Detector，将Live选择 框勾上，然后开始设置下部的Lifetime Sample 1菜单，在Rates标签内一边观察Stop Rate 一边调节Iris Setting使Sto

9、p Rate务必在2000以下，再在Time Range标签内选择一 个合适的Time Range和Channels，在Stop Condition标签内根据样品情况选择一个合 适的条件，设置好之后，点击New开始测试。(五) 数据处理1. 测量完成后，点击保存将原始文件保存到“C:users导师自己的文件夹”；2. 点击“Zoom In”按钮，然后在图上选取一个需要进行拟合的范围，在Data菜单 下选择“Exponential Fit中的Tail Fit，在弹出的窗口内输入数值进行拟合，得到衰减 寿命；对于寿命很短的样品，在样品测量完成后，要做仪器的衰减（即IRF）。3、拟合完成后，保存拟合的文件，共三种类型的文件，原始文件,ASCII文件 和图片文件：直接点击保存可以保存原始文件，点击File选择Export ASCI I即可以保 存成文本文件；选择save as，保存文件类型选择为Windows MetaFile可以保存成图 片格式。（六）关机程序1. 关闭F900程序和计算机；2. 关闭CO1电源，F900电源和主机电源；3. 关闭laser电源以及其他使用过的仪器；4. 在使用记录本上做好使用记录。（七）思考题1、荧光寿命测量中 stop rate 为何不能超过 2000？2、如何选择laser的重复频率和寿命测量的“时间窗口”？