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1、养麦内转录间隔区（ITS）的扩增及序列分析生物科学2002级 曾子贤指导老师 吴 琦 副教授摘要：本研究以野生金养麦、栽培苦养为材料，采用改进的CTAB法提取养麦总DNA。 设计一对特异性引物，对三份养麦ITS区序列进行PCR扩增，均获得长约700bp的单一条 带PCR产物测序结果表明，野生金养麦1号测序片段为699bp,包含ITS区序列为660bp； 野生金养麦2号测序片段为678bp，包含ITS序列为646bp；苦养测序片段为640bp，包括 ITS序列为599bp。将所得到的三份养麦ITS区序列分别与GenBank中登录的养麦ITS序 列进行比较。结果表明，野生金养麦 1 号与已知金养麦
2、 ITS 区同源率为 90.8%，野生金养 麦 2 号与已知的金养麦 ITS 区序列同源率达到 91.6%。供试苦养与已知苦养 ITS 区同源率 为 99.8%。关键词：野生金养麦；苦养；内转录间隔区（ITS）序列；5.8S rDNA； PCR；序列分析Amplification and Sequences analysis of InternalTranscribed Spacer of BuckwheatZENG Zi-xian Biological Science, Grade 2002Directed by WU Qi （Associate Prof. Ph. D）Abstract：W
3、ildness F. cymosum and cultivated F. tataricum were investigated in this article. By the improving method of CTAB DNA extraction, total DNA from three buckwheat was obtained. A pair of specific primers was designed. The ITS regions of three buckwheat were amplified. The amplified fragments, about 70
4、0bp in length, were sequenced directly. The results show that the sequencing fragments are 699bp, 678bp and 640bp in length, including ITS regions of F. cymosum and F. tataricum are 660bp, 646bp and 599bp in length. Comparing F. cymosum and F. tataricum with sequences reported, it suggests that the
5、homology rate of ITS sequence of F. cymosum, NO. 1 is 91.6% and NO. 2 is 90.8% and the homology rate of the ITS sequence of F. tararicum is 99.8%.Keywords: Wildness F. cymosum; F. tataricum; ITS sequences; 5.8S rDNA; Sequence Analysis养麦属于蓼科(Polygonaceae)养麦属(Fagopyrum Mill)植物。养麦不仅是营养丰富 的粮食作物，也是有较好药用价
6、值的药用植物。因此开展荞麦属植物的系统发育和分子进 化研究，进一步完善养麦属植物的分类和新种、野生种的鉴定，对丰富的养麦遗传资源保 护和利用以及养麦属植物的开发和改良提供系统学资料。KweonHeo 等1对养麦属的野生种进行了分类，将其划分为3 大类(表 1)。表 1 养麦属的分类第 1 类F. esculentumF. homotropicum F. esculentum. Ancestralis第2类F. cymosumF. tataricum F. tataricum. potaniniF. callianthumF. lineareF. capillatumF. macrocarpum
7、第3类F. gilesiiF .pleioramosumF. gracilipesF. rubifoliumF. leptopodumF. staticeF. urophyllum近年来，分子生物学研究技术如RFLP分析、AFLP分析、SSR分析、RAPD分析、DNA 序列分析为分子系统学的研究提供了重要的分子标记资料。其中核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列分析已被广泛的用于植物属内、近缘属间的系统发育分析2。对于养麦种间亲 缘关系，国际上多从传统的形态学、种间可杂交性、同功酶、 cpDNA、 rDNA、 rbcL、 accD、 RAPD和ITS等方面进行研究。植物基因组因其结构和功能上的
8、差异，进化速率有所不同。核基因组(nDNA)进化最快， 约为叶绿体基因组(cpDNA )的2倍，线粒体基因组(mtDNA )进化最慢，还不到叶绿体基因组 的1/ 3。由于cpDNA的进化速率远远低于nDNA，限制了其在较低分类阶元(如属、亚属) 中的应用。因此，众多的研究者将注意力集中至到1DNA中进化较快的DNA序列上，18S-26S 核核糖体DNA (nrDNA)的内转录间隔区ITS(Internal transcribed spacer)正是符合要求的 序列之一。植物细胞核中，编码rRNA的基因是一些高度重复序列组成的多基因家族，其中，编码 核糖体小亚基rRNA的18S基因与5.8S、2
9、6S基因共同构成一转录单位(图1所示)。其中， 18S与5.8S、26S间的基因间区分别为内转录间隔区(ITS) 1和2。也就是说，ITS区被5.8S 分隔成ITS和ITS2两个区域。ITS和ITS2的转录物在rRNA加工的过程中被切掉，但这两部 分在nrRNA成熟过程中具有重要作用。18s Nuclear rDNAITS15.8s rDNAITS226s Nuclear rDNAITS Region图1 ITS区域结构(仿刘金姐2000)本实验通过 GenBank中发表的养麦ITS序列(AB000325-AB000329, AB000339, AB000340)比对，根据White等(199
10、0)所报道的4条经典ITS序列的引物,设计一对特异 性引物，以三份养麦总DNA为模板进行PCR扩增，用扩增产物直接测序(包括ITS、5.8s rDNA和ITS2),将这三份养麦的ITS序列与GenBank中登录的养麦ITS序列进行同源性比较 和序列分析，为养麦的系统演化以及养麦的分类鉴定提供分子遗传学证据。1材料与方法1.1 材料三份实验植物中，野生金养麦(F. cymosum) 1号采集于四川农业大学老板山，野生金 养麦(F. cymosum) 2号和苦养(F. tataricum)栽培种由成都高等烹饪专科技术学校唐宇教 授提供。1.2试剂和仪器DNA 提取液(50mmol/L Tris-C
11、l，25mmol/L EDTA，300mmol/L NaCl，1%SDS， 1%PVP),无水乙醇，70%乙醇，氯仿和异戊醇(24： 1), 5 mol/L KAc，TE(10mmol/L Tris-Cl， 1mmol/L EDTA，H2O)，RNaseA，ddH2O，10xPCR buffer，25 mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs，Taq酶(PCR扩增试剂均购自上海生工)，GoldView (购自赛百盛)，0.8%琼脂糖 凝胶。Bio-Rad凝胶成像系统，Eppendorf PCR仪，水平电泳仪，-20C冰箱，制冰机，Thermo 冷冻离心机，普通离心机，Unico
12、UV-2102C型紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，灭菌锅， 研钵，离心管，冰盘。1.3 方法1.3.1三份养麦总DNA的提取采用在CTAB法以及王莉花等提取方法基础上改进的SDS微量快速提取DNA。1.3.1.1将100mg养麦嫩叶放入置于冰上已灭菌的研钵中，再加入300“LDNA提取液充分 研磨；1.3.1.2将磨细的样品转移到置于冰上的已灭菌的1.5mL离心管中，再向研钵中加入300yL DNA提取液并转入同一离心管中；1.3.1.3将离心管置于65C水浴1小时，并不时轻轻上下颠倒离心管；1.3.1.4再加入125吐5M KAc冰浴30分钟，再向离心管中加入400吐 氯仿/异戊醇（24：
13、1）, 冰浴 20min；1.3.1.5将样品于4C下，4000rpm离心15min,取上清液并转入另一灭菌的离心管中，并加 入 2.5 倍体积的无水乙醇，上下轻轻颠倒；1.3.1.6在4C下，8000rpm离心4min，而后弃上清液；1.3.1.7用70%乙醇漂洗沉淀1-2次，放入50C烘箱干燥15min；1.3.1.8用50吐TE溶解DNA，用含GoldenView的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，测定OD260 及OD280,确定DNA的纯度及含量。置于-20C冰箱中保存备用。1.3.2 ITS 序列引物的设计根据 GenBank 里已登陆的养麦 ITS 序列 AB000325-AB0003
14、29, AB000339, AB000340 和Yasuo Yasui等、White等报道的引物序列，设计、选取出一对特异引物：Primer1： 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3Primer2: 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC3-这对引物的扩增区包含了 ITS1、 5.8S 和 ITS2 完整区域。引物由上海英骏生物技术有 限公司合成。1.3.3三份养麦ITS序列的PCR扩增在赵晖等9报道的雪腐核盘菌 ITS 序列扩增体系及循环程序基础上，改进反应体系以 及退火温度和延伸时间。采用PCR总体积50yL，反应体系如下：ddH2O38.5 吐10xBuffer5yL25
15、mmol/L MgCl22yLdNTP mixture1yL20umol/L Primer11yL20umol/L Primer21yL模板 DNA1yLTaq DNA聚合酶0.5吐(5U)总体积50yL按照上述顺序分别加入，反应循环程序：95 C3min94 C30sec 52.5C 1min 30 个循环72C55sec72C10min4C保存1.3.4 PCR 扩增产物的检测取5吐PCR产物与1吐6xLoading buffer混匀，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。1.3.5 PCR 产物直接测序将 PCR 产物直接送上海英骏生物技术有限公司纯化和测序。本实验选取的一对引物均位于ITS序列以外(图2), ITS位于18s rDNA, ITS4位于26s rDNA5。因此直接采用下游引物 进行单向测序，另一条链则以互补配对原则得出序列。图 2 ITS 序列引物所在位置1.3.6 ITS 序列分析将 三 份 荞 麦 rDNA 的 ITS 序 列 的 测 序 结 果 与 已 登 陆 的 荞 麦 ITS 序 列 (AB000325-AB000329, AB000339, AB000340)比较，确定ITS和 ITS2 的范围。用生物 信息学分析软件DNASTAR 5.0对本实验序
