《核酸分析汇总》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸分析汇总（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第五章核酸分析(Nucleic aicds)第一节基础知识一核酸的基本概念 核酸生物大分子线性多聚核苷酸 P444核酸多聚酸 polynucleotide戊糖核糖Ribose 脱氧核糖 dexoyribose+碱基腺嘌吟Adenine-A 鸟嘌吟Guanine-G 胞嘧啶 Cytosine-C 胸腺嘧啶 Thymine-T磷酸尿嘧啶Urac il-UDNA 脱氧核糖核酸 dexoyribonucleic acidRNA 核糖核酸 ribonucleic acid核酸存在于细胞中，DNA细胞核RNA细胞质病毒目前最大分子，电镜下可见，二.DNA结构天然DNA右手双螺旋链状结构，碱基(A,T,C,
2、G)互补结合(氢键)(base complementary),遗传信息载体，极重要生物学意义，DNA 复制，转录。反转录结构：P446糖和磷酸脂化反应形成链的框架 糖碱基缩合反应糖苷键三.RNA结构1结构：线形多聚合苷酸，与DNA结构不同点 戊糖核糖 AGCU-用V尿嘧吟代替胸腺嘧吟 单链线形分子，局部双螺旋，自身回折2. 种类：三种核糖体 RNA(ribosomal RNA rRNA)转运RNA(transfer RNA tRNA)在蛋白质合成过程中具有转 运 AAs 的作用信使RNA (messager RNA mRNA)以DNA为模板又是蛋白质 合成模板遗传信息DNA 转录一mRNA翻译
3、，转译一蛋白质模板复制transcriptiontranslation直接模板replication每种 mRNA 携带从 DNA 转录的一种或几种蛋白质编码遗 传信息tRNA携带AAs,可确认mRNA编码DNA 结构1953425 Nature 900 词 文章Watson 沃森 (25) 生物学家Crick 克里克 (35) 物理学家1951 秋 Watson 美国博士后，丹麦哥本哈根那不勒斯开会，威尔金斯DNA报告英国剑桥大学卡文迪许 实验室 威尔金斯，富兰克林， x 线衍射，螺旋结构 鲍林，化学家蛋白质a -螺旋沃-克：数据；方法积木提示氢键 遗传信息的提示碱基互补第二节 核酸提取、分
4、离、纯化提取对象：细胞，组织中一一染色体，DNA RNA细菌，质粒 DNA提取过程：细胞组织破膜、释放、内容物 分离提取液，除DNA, RNA以外的组分 DNA，RNA浓缩一细胞中 DNA 提取 细胞组织在裂解液中（Triton X-100和SDS缓冲液） 匀浆溶膜破解一一提取液 利用蛋白水解酶和核糖核酸酶温育，除去蛋白质和RNA DNA提取，进入乙醇见书 P449（1）在 6 Vols 裂解液中匀浆（2）除细胞碎片和离心方法（3）温育，与蛋白酶 K 温育（4）CHCL3 3 酚萃取，除蛋白（5）沉淀核酸 DNA, RNA 乙醇（6）重新溶解， Tris 核糖核酸酶（7）沉淀 DNA 无水乙醇
5、，离心（8）溶解另一种分离提取方法CsCL 密度梯度离心，超速离心_分离蛋白，DNA RNA原理：密度不同，沉降速度不同一一方法：超速离心65000转/min 6小时 （45000 转 /min 36 小时）CsCL 浓溶液 8mol/L ， 溴乙锭染色，示踪，分离，见书P451二电泳分离方法 方法，标准技术，琼脂糖电泳，简单快速，分辨率高 原理：电泳-中性碱性条件下，磷酸基团带负电荷，移向正极，凝胶-分子筛效应，小快大慢凝胶孔径一一大小由琼脂糖浓度决定， 0.52%20050000 碱基对 装置：如图 P452，小碱基数(v200)DNA片段分离，需采用聚丙烯酰胺凝 胶，分离毛细管凝胶电泳，
6、 线性凝胶电泳96通道毛细管电泳阵列测序微流控芯片384 通道芯片 定位，示踪，DNA标记结合染料，溴乙锭，加入凝胶中 ethidium bromide(EtB)嵌入式荧光染料，插入DNA碱基对之间结合，紫外光 300nm 激发棕红色荧光 590nm如图P453 回收：凝胶上样品DNA回收 常用方法：定位，切割胶块，放入透析袋中，电泳DNA由胶释放，吸附透析膜上，反向通电30 - 60秒钟，DNA回进缓冲液中， 苯酚抽提，乙醇沉淀，回收率 50%三色谱分离方法HPLC 高效液相色谱 反相色谱：利用不同片段疏水性不同分离V 50碱基达到很高分辩率，可分辨一个碱基的差别相同碱基数，不同碱基组成片段
7、，疏水性 不同图 P454离子交换色谱：利用电荷，尺寸大小，分离大片段，四核酸的变性、复性及杂交 变性（denaturation）定义：核酸双螺旋区氢健断裂，变成单链 不发生链内共价（化学）健断裂， 不发生序列（碱基）的变化，种类：温度升高-热变性，80-100C, 酸碱变性 甲醛、尿素 常见变性剂如DNA稀盐溶液，加热80-100C分子内碱基配对DNA 解链温度 T T 升高特点：一变性，爆发式，很窄温度范围，一般70-85匕之间开链达到一半时温度， DNA 熔点，熔解温度tmM见 P456 复性(renaturation)变性DNA在适当条件下，由单链重新结合成双螺旋复性方法：已经热变性D
8、NA骤冷却，不能复性慢冷却 可复性 影响因素DNA片段越大，复性难，DNA浓度越高，复性易 核酸的杂交(hybridization)不同来源 DNA 在同一容器，经历热变性，复性过程， 一一如异源DNA之某段区域有相同序列 复性时形成杂交 DNA 分子第三节 核酸分析方法一紫外分光光度法1原理： 嘌呤，嘧啶含共轭双键 碱基核苷核苷酸核酸240 290nm 有吸收，2260nmmxz2 应用 粗定量，吸收系数法A260nm=1 C =50 ug/mL双链 DNAC=40 ug/mL单链 DNA RNA 纯度检查A /A =1.8260nm280nm等于此值， DNA 纯度高 大于此值，含RNA杂
9、质 小于此值，含蛋白质杂质RNA A /A =2.0260nm280nm 变性、复性监测图 P456变性， A 上升，复性， A 下降二化学方法比色法 荧光法 用得不多，不介绍 三酶法1限制性内切酶，Restriction endonucleases 1979, W.Arber H.Smith, D,Nathans 发现存在于细菌中，除解外界侵入DNA,不清除本身DNA 功能：专一性，识别双链 DNA 上特定点位，将两条链切断， 非常有用，象一把手术刀， 限制酶识别特定点位 48碱基对 种类 350 余种命名EcoRI大肠杆菌属名，种名，菌株，酶编号常见内切酶，见表P4592DNA 连接酶 Ligase3DNA 聚合酶 DNA polymerases 功能催化与一个已有 DNA， RNA 单链（模板 Template 互补的 DNA 新链的合成，种类多，重要Taq聚合酶，热稳定聚合酶，70 -80C，最大活性，90C保持活性，提取自生活于温泉中细菌 四特异（定）序列DNA的检测Southern印迹法英国分子生物学家，Southern发明过程：DNA 分子限制性片段琼脂糖凝胶DNA 变性吸附转移 至硝酸纤维素+标记DNA探针杂交
