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1、1. 基因工程的四大要素、和。目的基因，工具酶，载体，受体细胞2. 乙醇沉淀DNA的原理是。乙醇使DNA分子脱水3. 在DNA分离过程中造成DNA分子断裂的因素主要有、和。核酸酶降解，化学降解，物理剪切4. 基因工程是在上世纪年代发展起来的遗传学的一个分支学科。Cohen等在年构建了第一个有功能的重组DNA分子。碱法分离质粒DNA时，溶液I的作用 ，溶液II和溶液III的作用分别是使DNA。悬浮菌体，变性和复性。5. 通常可在三种温度下保存DNA： 45C、-20C、-70C，其中以最好。-70C1. 关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确？ ( d )(a) 溶液I的作用是悬浮菌体(
2、b) 溶液II的作用是使DNA变性(c) 溶液III的作用是使DNA复性(d) 质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性 2同一种质粒DNA,电泳时，三种不同形式的迁移速度是(a )(a) SC DNAL DNA0C DNA(b) SC DNA0C DNAL DNA(c) 0C DNASC DNAL DNA(d) L DNA SC DNA0C DNA3.用碱法分离质粒DNA时，因为(c )所以可以被除去(a) 染色体DNA断成了碎片(b) 染色体DNA分子量大，而不能释放(c) 染色体DNA变性后来不及复性(d) 染色体末同蛋白质分开而沉淀4.1953 年 Watson 和 Cri
3、ck 提出：( a )(a) 多核苷酸DNA链通过氢键连接成一个双螺旋(b) 三个连续的核苷酸代表一个遗传密码(c) 遗传物质通常是DNA而非RNA( d) 分离到回复突变体证明这一突变并非是一个缺失突变1.外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后，这个基因不再有任何功能。(X)1. PCR扩增的基本原理是什么？用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样信息？PCR反应是在模板DNA、引物和dNTPs存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反 应，它根据 DNA 半保留复制的原理，在体外模仿细胞内 DNA 复制的过程，首先使模板 DNA 变性，两条链解开，然后使引物与模板退火，二者碱基
4、配对， DNA 聚合酶随即以四种 dNTP 为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。进行PCR扩增，应对目的基因片段两侧的序列了解清楚，至少要预先知道足够合成一对 引物的靶DNA序列。2. 在DNA分离过程中，为何常常酚：氯仿联用？酚与水有一定程度的互溶，单独用酚抽提DNA不能完全除去酚，而残留的酚抑制限制性 内切酶和连接酶活性，甚至导致酶变性，而氯仿也是蛋白变性剂，它不与水互溶，而与苯酚互溶，故可带去残留酚。4用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样信息？引物设计的一般原则有哪些？进行 PCR 扩增，应对目的基因片段两侧的序列了解清楚，至少要预先知道足够合成一对 引物的靶 DNA
5、序列。引物设计的一般原则：a. 长度 1530bp, Tm 接近 72 C。b. G+C占50%60%，避免单一碱基的连续排列，一般两端G+C含量近似。c引物3端必须与模板DNA互补。d. 一对引物间不能有4个以上的碱基互补。e. 引物本身应避免有回文序列。5. 为什么氧化变色的酚不能直接用于DNA的分离？应如何处置？苯酚呈酸性，易氧化产生自由基，直接用于DNA的分离，能够引起磷酸二脂键断裂，造 成DNA降解，故氧化的酚需经重蒸除去氧化物，然后用Tris-Hcl饱和，调pH至中性使用。 饱和酚可防止酚吸收更多DNA溶液，以降低DNA损失率。6. 分离DNA时，为什么要在缓冲液中加入一定浓度的E
6、DTA和蔗糖？（1）EDTA是螯合剂，可同Mg2离子螯合，使核酸酶失去了作用的辅助因子，而抑制核 酸酶的活性；（2）蔗糖可增加缓冲液的黏度，保护DNA不易断裂。7. 抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子 之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密 度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。 而酚与氯仿有机溶剂的比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚 与水相有一定程度的互溶，
7、大约10%15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的 DNA,且单独用酚抽提DNA不能完全除去酚，而残留的酚抑制限制性内切酶和连接酶活性， 甚至导致酶变性，而氯仿也是蛋白变性剂，变性作用虽不如酚效果好，但它不与水互溶，不 会带走DNA，而与苯酚互溶，故可带去残留酚。所以在抽体过程中，混合使用酚与氯仿效果 最好。&为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊醇？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈震荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡， 气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的 泡沫产生。一般采用氯仿与异戊醇为 24：1之比。也可采用酚、氯仿与异
8、戊醇之比为25： 24：1，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂 相维持稳定。9. 提取DNA时为何使用无水乙醇沉淀DNA？这是实验室最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以以任意比例和水相混溶，乙 醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易 于聚合。10. 为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？氧化后如何处理？苯酚呈酸性，易氧化产生自由基，引起磷酸二脂键断裂，故重蒸除去氧化物，然后用 Tris-Hcl饱和酚，调pH至中性。饱和酚
9、可防止酚吸收更多DNA溶液，以降低DNA损失率。 氧化的酚可经重蒸后使用。11. 为什么要用 pH8 的 Tris 水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样 品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下 比较稳定。在中性或碱性条件下（pH57）, RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得 RNA含量较少的DNA样品。保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色，这样的酚容易降解DNA，一般不 可以使用。为了防止酚的氧化，可加入巯基乙醇或8-羟基喹啉至终浓度
10、为0.1%。 8-羟基喹 啉是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是 金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，应分装在棕色试剂瓶里，上面盖一 层 Tris 水溶液或 TE 缓冲液，隔绝空气，也可充入氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保 存在4C或-20C冰箱中，使用时，打开盖子吸取后应迅速加盖，防止氧化。12. 从细胞中分离DNA时为何往往会断裂？因为（1）细胞内存在很高的核酸酶活性， DNA 裸露后，易降解；（2）酸碱化学试剂也 会使DNA断裂；（3）多次离心、吸取、转移等，产生的机械张力剪切会使DNA断裂。1. 制备的 DNA 在
11、什么溶液中较稳定?2. 为了保证植物 DNA 的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？3. 核酸提取的原理4. DNA 提取的常用方法5. RNA 的主要分子类型6. RNA提取过程中如何防止RNA酶的污染？7. 核酸的浓度和纯度如何确定？8. 电泳及电泳的原理9. 琼脂糖凝胶电泳的优点及缺点？10. 电泳常用的指示剂有哪些？作用原理？11. 聚丙烯酰胺凝胶电泳的优缺点1制备的 DNA 在：（1）含有螯和剂如 EDTA 中较稳定，因为 EDTA 能螯和 Mg2+ 或Mn2+离子，抑制DNase； （2）在pH59之间较稳定，否则过酸过碱会破坏DNA 的结构；（3）有一定离子强度（强度越高,
12、 DNA 越稳定）的溶液中较稳定。（ TE 满 足以上要求，但如需对所得DNA进行酶切，EDTA浓度不可过高，一般用0.1 X TE 或 0.2XTE）。2 为了保证植物 DNA 的完整性：（1）整个提取过程应在较低温度下进行（一 般利用液氮或冰浴）；这样可防止和抑制内源DNase对DNA的降解；（2）当DNA 处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔；在进行 DNA 溶液转移 时用大口（或剪口）吸管，尽量减少对溶液中 DNA 的机械剪切破坏。1 、 PCR 反应体系包含哪些成分？2、PCR 的反应步骤？3、PCR 的反应原理？4、引物设计的原则？引物的延伸方向？5、影响PCR的因素？
13、1. 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有（ b ）不太恰当。（a）由作用于同一 DNA序列的两种酶构成(b) 这一系统中的核酸酶都是II型限制性内切核酸酶(c) 这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰(d) 不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统2. 限制性内切核酸酶可以特异性地识别和切割( b )。(a) 双链DNA的特异碱基对(b)双链DNA的特异碱基序列(c)特定的三联密码(d)以上都正确3. 限制性内切核酸酶的星号活性是指( a )。(a) 在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性(b) 活性大大提咼(c) 切割速度大大加快(d)识别序列与原来的完全不
14、同4下列限制性内切核酸酶中，选用(b )时要考虑连接后外源DNA的插入方向。(a) EcoR I(b) EcoRII(c) BamH I(d) Pst I5. DNA连接酶的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，( a )。(a) 将双链DNA中的5, -P同丁 -OH末端重新形成磷酸二脂键(b) 作用时不消耗能量(c) 需要Mn2+等二价辅助离子( d) 也可以连接 RNA 分子1. 限制性内切酶的命名原则？2. 限制性内切酶的酶切产物有三种类型： 5-端突出；3端突出；平末端。3. 什么是限制现象？粘性末端？同裂酶？同尾酶？ 星活性？4. 影响限制性内切酶活性的因素？诱发星活性的因素？1
15、限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过对外源DNA的修饰和对自身 DNA的限制实现的。(V )2. 迄今发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链 DNA，又能作用于单链DNA。 (X )3限制性内切核酸酶通常保存在50%浓度的甘油溶液中。(V )4. 在限制与修饰系统中，修饰主要是甲基化作用，一旦位点被甲基化了，其他的 限制酶就不能切割了。(X )1. 基因工程中有哪3 类主要类型的载体？2质粒DNA在提取过程中，产生3种不同的构型，它们在电泳时泳动速度有何不 同？3. 理想的质粒载体应具备哪几个条件？4你对天然质粒pSC101和ColEl有哪些了解？5. pBR322和pUC系列载体的特点？它们的复制子，抗性基因来自哪里？6. 久噬菌体载体的优点与不足？7黏粒载体的特点？
