基因组翻译最终版

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1、摘要我们做了一个牛-羊的阵列比较基因组杂交试验，使用一条基于牛基因组上设计的平滑 的含有385,000个寡核苷酸的探针来确定羊基因组中的拷贝数变异（CNVs）,用来分析意大 利母羊的乳制品，和乳肉两用的品种（Bagnolese, Comisana, Laticauda, Massese， Sarda, 和Valle del Belice）。我们确定了 135CNV的区域（其中24个已经不止在一个动物中被报道 过了）覆盖了大小为10.5Mb，平均数和中位数分别为77.6kb和55.9kb，被简称为牛基因组 （0.398%）的虚拟羊的基因组。通过对已确定羊的CNVRs和已经报道过的牛、山羊基因组

2、的CNVRs杂交分析得出：羊与其它物种的CNVRs的重叠存在显著差异。（Pv0.0001）这表 明不同的基因组区域可能包含经常性变异的CNVRs。许多羊的CNVRs包含了许多具有生 1物.学引功能言的基因。评价这些基因的相关功能仍需进行进一步的研究。随着诸如阵列比较基因组杂交等大量基因组分析方法的到来，拷贝数变异CNVs（大小 从1Kb到几Mb的DNA片段与参考的基因组间进行比较发现，该DNA存在一个易变的拷 贝数目）代表了遗传变异的来源。举个例子，在集合许多的研究发现人类基因组中大概有30% 的基因是受CNVs影响的。CNVs可以改变基因的结构和剂量，可以基因的表达和功能，根 据这些作用，C

3、NVs有在决定表观差异时发挥重要的作用的潜能。许多的CNVs代表良性的 多态性变种，然而许多其它的CNVs却是导致或是与人类中的孟德尔遗传病或者复杂的遗传 病有关。随着在人类中创举性试验的开展，在广泛的基因组CNVs的调查中：老鼠、鼠、黑 猩猩、恒河猴、狗、猪、牛、山羊（goat）和鸡已经相继被报道存在CNVs 了。这表明该种 变异普遍存在于脊椎动物和低等物种中。通过使用牛和人的基因组来进行山羊（goa t）与大猩 猩的跨物种aCGH实验的调查中就分别考虑了两种反刍动物和两种灵长类动物的亲近程度。 跨物种杂交的实验同样也适用于使用基于阵列的鸡去识别火鸡、鸭子和斑马雀中的 CNVs。 此外，灵长

4、类动物（人大猩猩和恒河猴）的比较分析和反刍动物（牛和山羊goat）的比较 分析中表明了经常性的CNVs跨亲密物种而存在，这表明了祖先断节的重复数和其它的机制 可能会促进 CNVs 的形成。通过对一些在家畜中的研究表明， CNVs 影响与表性特征有关的基因和基因组区域。举 个例子：主导猪白色斑点所在处的基因包括了由KIT基因拷贝数目决定等位基因。在S0X5 基因的第一个内含子中的CNV通过引起PRLR和SPEF2的部分重复引导致了鸡的豌豆冠性状 和影响了 avin物种晚期羽化的轨迹。CNV同时也影响羊（sheep）和山羊中的豚鼠轨迹，同时 也促进这两种羊的毛皮颜色变异。羊（sheep）基因组不断

5、的从进化遗传学、细胞遗传学和混合辐射图谱学中不断得到改进。 基于牛、狗和人类基因组集合的虚拟基因组图谱，最近也被生产出来了，这次试验充分使用 了两在种反刍动物间的同源性和保守的共线性，和从比较基因组学中可以得到的一些更高级 的数据。接着，国际羊（sheep）基因联盟产生了提一张绵羊（ovine）基因组图谱的草图，但就 其组装和注解而言，能需要进一步的完善。此外，在跨越大量品种的sheep hapmap课程中 使用和发展中低密度的的单核苷酸多态（SNP）板,是为了更好的评价这些物种中的差异程度。 然而，羊（sheep）基因组中的CNVs的差异水平到目前为止仍未被评估过。我们使用了基于牛基因组的跨

6、物种aCHG实验，初步得到了绵羊（sheep）基因组中CNVs 的比较图谱。2.结果与讨论2.1绵羊（sheep）基因组中的CNVs在这次研究中，我们选择了亲缘关系密切的牛和羊（sheep）的基因组中高度保守和同 源的序列进行分析，以说明我们在发现山羊基因组中的 CNVs 的方法同样也适用于绵羊 （sheep）基因组中CNVs的发现。我们使用了基于Btau-4版本的Bos牛的基因组集合设计 的，含有385000个寡聚核苷酸探针的定制的平滑阵列，分析了以Sarda母羊的DNA作为参 照组的6个不同的意大利乳用品种或者乳肉两用的品种（Bagnolese, Comisana, Laticauda,

7、Massese， Sarda,，和Valle del Belice）进行比较的11个基因组DNA样本。采用特殊的评价标准来认为跨物种aCGH实验的CNVs已经被牛-山羊的aCGH研究所吸 收和证明（参考材料和方法）。CNVs被报道使用了数据分割和求平均值等10种不同的算法 来实现在CGH网站服务器的实施。图1：举了一些在不同羊（sheep）中被确定的CNVs的 例子。通过这种保守的方法，我们供报告了 186个CNVs（表1和补充文件1）。大概有61% 的CNVs仅在一个动物中被发现，它们的平均长度为73.9kb（表1）。Bagnolese物种中CNVs 数量的平均值被证实是最多的（24.5个）

8、。而Massese和Sarda中的CNVs的数量的平均值 最少（13.5个）。Sarda羊中最低数目观察值是以同一品种的不同羊的DNA作为参照的。这 种结果符合在老鼠，狗和山羊 aCGH 实验得出的结果：同一主题下，作为参考系的品种表 现出最低数量的CNVs，动物间低遗传变异是由它们的亲缘关系亲近所派生的。这些数据间 接证明了 CNVs可能在种群遗传分析、品种特性有重要作用，同时也表明我们发现的大部份 CNVs是正确被确定的。为更有力的支持后者，我们通过了半定量荧光PCR （SQF - PCR） 来确定BTA4, BTA19和BTA23上的三个CNVs。（使用牛（cattle）的染色体作为参照

9、）（表 1）把所有羊的分析结果考虑在内，我确定基因组的中CNVs的平均数量为16.9.这个结果与 牛-山羊研究（17.9 个）中的报道相当。使用 385000 个寡聚核苷酸探针来分析牛（11.6 个 CNVs），狗（17.2个CNVs），和鸡（9.6个CNVs）的基因组aCGH的实验也得到了相似的 结果。两个也被称为自我-自我杂交的CNVs （与其它的CNV没有重叠）提供了一个在CNVs 确定中粗略计算实验假发现率的计算方法。（FDR=12%）与我们在牛-山羊试验报道中得出 的结果（FDR=11%）差不多。然而，由于技术的限制，不同样品间DNA质量特性的差异和 参照基因组和杂交实验组中参照的D

10、NA的序列不同，使得很难精确的估计实验的假发现率 （PDF）。在其他使用同源性DNA杂交的实验中，通过自我-自我杂交来估计的实验假发现 率FDR的范围从狗中的3%到人类中的24%。CNV区域（CNVRs）由先前报道过的不同物种中确定的聚合重叠CNVs决定，这也是 考虑到我们使用我们实验特异性中使用的保守方法。（参考材料和方法以得到更详细的信 息）。总而言之，我们确定了参照牛（bovine）基因组，Btau-4.0版本（图2和补充文件2） 的包含10.5Mb（0.98%）虚拟羊基因组的135CNVRS。考虑到24条染色体和由于解释结果的 困难有组装的 X 染色体没有被包含在平滑阵列中。135个C

11、NVRs中包含了 75个丢失和59个获得，还有1个包含这两个事件的。（补充文 件2）在这些CNVRs中，18在不同品种的多个动物中被发现，5个是在相同的和不同的物 种的多个动物中被发现的，还有1个是在同一个物种的多个动物中发现的。（Laticauda, 112 号CNVR）。所有不止在一个动物中发现的（18%）,被称为高置信水平CNVRs,所有仅在 一个动物中被发现的，被考虑是第二水平置信水平的CNVRs （补充文件2）。135CNVRS的 平均数和中位数分别为77621和55876bp。范围是24697（BTA18, CNVR no93）到505055bp （BTA12, CNVR no.7

12、2）。这些数据多与山羊基因组报道（平均数和中位数分别为90292和 49530bp）具有相同的规模。使用一种相似的基于刘等平台的aCGH得到牛的177个高置信 水平CNVRs的平均数和中位数分别等于159和89kb。牛和羊或山羊之间的这些区别是由相 似基因组的 aCGH 来坚定的，而这可能归因于 i。 ）其它因素可能是来自于在对动物的分析 和他们在物种间的关系，这个也许能够增加探寻到更大的CNVRs的可能。在一些其它的 aCGH 实验和我们的绵羊数据中，减少的结果的数量比增加的结果数量还来 得多。这自然很有可能是基于参照DNA的使用。然而，似乎aCGH的检测方法更加倾向于 标识的缺失。但是，从

13、我们所掌握的知识来看，还没有任何人从事过这一可能偏差的系统性 分析。2.2 绵羊和其他反刍动物 CNVRs 的比较分析假设我们从绵羊中鉴定得到的CNVRs和其他反刍动物中呈报出的CNVRs发 生重叠这一情况下为了进行估算，我们对从五个独立的牛或羊的实验中所获得的结 果进行比较。其中三个实验（两个牛的和一个山羊的）实现了使用铺盖着寡核苷酸 或者包含着63万的aCGH。另外两个牛的实验使用启发牛SNP50的微珠芯片包含着大 约50K的SNPs。从绵羊和山羊中获得的 aCGH结果之间的重叠具有重大的意义 （pvO.OOOl）.比较山羊和牛CNVRs，我们获得了相同的结果，进一步提出了被公认的具 有周

14、期性的 CNVRs 是通过牛科家族的不同物种来下呈现的。不同物种间具有象征性的 CNVRs重叠在对人与黑猩猩及猕猴两者的基因组的比较也是观察得到的。这两种非人类的 灵长类动物与人类血统在60250万年前就已经发生背离了。这些结果都暗示了某些基因组 区域倾向于 CNV 的反复生成以及在灵长类和偶蹄类进化血统中的不稳定性。在大约 170230万年前的第三世纪中新世，牛、绵羊和山羊共有一个相同的祖先。17002300万年前，然而绵羊和山羊家族早已在距现在6001400万年前就分开了， 家族或血统的祖传特征的成倍复制可能可以作为这些循环往复的CNVRs的资源。事实上部 分复制本已经被证明是在牛中的那些

15、CNVRs的显著层叠，在其他物种中也是如此。只有大 量成组的绵羊和山羊基因组是可利用的，那么去比较部分复制中使人们能够成功的跳过反刍 动物并估算CNVs在这一领域的发生率将会是件有趣的事。就牛的染色体而言，绵羊的CNVRs并不仅是为了被BAT1和BAT14呈报。BAT5包含 着11种CNVRs （数量最多），也是被山羊-牛的aCGH分析所呈报的。BAT25和BAT23 大部分被 CNVRs 所覆盖了（分别 1.44%、 0.94%），然而，使山羊染色体变得丰富的是 BAT17、BAT10、BAT18（他们分别占各自长度的1.6%、1.3%、1.0%）。使牛的染色体变 得丰富的（结合了 4种已经

16、提及的学科）是BTA28（7.81%）BTA15（7.35%）BTA27（7.22%）。 覆盖率的不同可能是由于牛的染色体所呈报的学科的数量这一因素所引起的。2.3 绵羊 CNVRs 的注释在135种绵羊CNVRs中有8种部分或者完全的包括牛被Ensembl标注的基因，包含 着290种Ensembl转录合成185、160和172所代表的基因本位统筹的分子功能、细胞组 件和生物进程以及265种不同的PANTHER关系。从228种Ensembl基因的188种中我 们取回了一种人类的同源基因。根据OMIM数据库所显示的可知，人类的基因中只有25种 基因的突变体会造成孟德尔序列的混乱，而只有一种与长寿有关。牛、绵羊、山羊的遗传病 中并不包含这 228 种牛基因中的任何一种。然而，我们可以预料得到一些增加或减少部分 或全部的基因复制体将会在动物或者其他物种中起着不同的决定性作用。几个GO类别（pv0.001或p0.05）在绵羊CNVRs中过度表现，及时在其它CNVs 种类相比之中似乎只包含有较少