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1、综合性实验 1 酵母蔗糖酶的分离纯化（一）实验目的学习酵母蔗糖酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实 验提供一定量的蔗糖酶。（二）实验原理酶是生物体内具有催化活性的物质，在人类生产生活和生命过程中起着非 常重要的作用。因此，酶学相关研究始终是生物学的重大课题。酶的分离提纯是为了提高 纯度（或比活力）及收率可据酶蛋白的结构和性质来选择分离提纯方法进行分 离，同时用测定酶活力的方法了解酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。蔗糖酶（Sucrase,EC3.2.1.26）又称转化酶，属于水解酶类，催化蔗糖分解成 D-葡萄糖和D-果糖，是一种广泛存在于自然界中的糖苷酶1。目前蔗糖酶已在 农产品
2、加工业2、食品工业3-4、医药行业5-6中发挥重要作用。工业上一般 从酵母中提取蔗糖酶7。蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式：存在于细胞壁中的高度糖基化的外 蔗糖酶和细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。外蔗糖酶活力占蔗糖酶活力的大部 分，是含有 50%（质量分数）糖成分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式。本 实验提取纯化的主要是外蔗糖酶。酵母细胞的破壁方法主要有研磨法、酶解法、反复冻融法、超声波破碎法 等8。酶解法耗时长、费用高，机械研磨法操作复杂、损耗大等9。超声波破碎法具有空化效应，产生机械剪切压力使细胞破碎，耗时短、费 用低，损耗小。本实验采用超声波破碎法破碎酵母细胞。（三）实验仪器、材料及试剂1
3、. 仪器（1）美国SONICSVCX 750型超声波细胞破碎仪、Eppendorf多功能台式离 心机5804R、恒温水浴箱、-20C冰箱、电子天平、制冰机（2）离心管（2ml、1.5ml、50ml）、移液器、滴管、50ml量筒、50ml烧 杯、玻璃棒2. 材料及试剂（ 1）活性酵母粉（市售安琪酵母粉）（2）0.2mol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH5.0）（3）95%乙醇（预冷-20C）（四）操作步骤1. 超声波法破碎酵母细胞（1）称取10g干酵母粉，放入冰预冷的50ml烧杯中，再加入30ml冰预冷 的0.2mol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液，用玻璃棒搅拌均匀成糊状液体。（2）酿酒酵母超声破碎条件
4、为:额定功率750W、振幅设置为20%，总工作 时间10min、工作时间/间歇时间15s/25s （总耗时约27min）。（3）将细胞破碎液平均分到2个50ml离心管中，配平后，4C， 9000rpm，离心 10min。（4）将上清液倒入 50ml 的量筒，量出总体积 V。（5）每组取1ml上清液至2ml离心管中，体积VI （标记为粗酶液I, Vl=2ml）o（6）每组另取20山粗酶液I放入1.5ml离心管中（标记为粗酶液I）,置 冰上保存，用于测定酶活力及蛋白含量。2. 热处理（7）将1ml粗酶液I迅速地放入50C恒温水浴中，温育20min,期间每隔 约 4min 温和混匀一次。（8）取出离
5、心管，迅速置冰浴冷却5min，4C，lOOOOrpm，离心10min。（9）将上清液转入新的2ml离心管中，用移液器量出体积VU,标记为粗 酶液口。（10）取出20山放入1.5ml离心管中（标记为粗酶液口），置冰上保存， 用于测定酶活力及蛋白含量。3. 乙醇沉淀（11）向剩余（V口-20山）粗酶液口中，逐滴缓慢加入等体积（VH- 200山），-20C预冷的95%乙醇，整个过程约10min。（12）配平后，4C，10000 rpm离心10min，吸弃上清。（13）用 1ml 冰预冷的 0.2mol/L 乙酸钠-乙酸缓冲溶液充分溶解离心管中的 沉淀5min，标记为粗酶液皿（Vm=1ml），置冰上保存用于测定酶活力及蛋白 含量。（五）实验结果记录实验各组分体积：V二待测Vl=1mlVH=待测V皿二1ml若有异常现象出现，可进行分析讨论。（六）注意事项1. 超声波破碎过程产生大量热，整个过程要冰浴进行。2. 乙醇沉淀时，边搅拌边逐滴滴加乙醇。3乙醇沉淀时，可将沉淀放入冰箱中-20C下保存备用。
