《质粒提取全过程》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒提取全过程（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、质粒提取全过程大肠杆菌感受态细胞的制备1 ）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中， 37弋振荡培养过夜2 ）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37弋振荡培养 23h。3 ）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min4 ）4C离心 10min （ 4000r/min ）5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽6 ）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴 30mi n7 ）4C离心 10min （ 4000r/min ）8 ）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上 放置）9 ）分装细胞，200ul 份,4C保存质粒
2、DNA的转化1 ）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀， 冰浴30mi n2 ）离心管放到42C保温90s3 ）冰浴2min4 ）每管加800ulLB液体培养基,37C培养1h （150r/min ）5 ）取适当体积（100ul ）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上， 正置30min6 ）倒置平皿37C, 1216h，出现菌落质粒提取步骤1 ）取14ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心 1min，弃上清2 ）加250ul溶液I/RNaseA（溶液I为细胞悬浮液）混合液， 漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min3 ）加入250ul溶液口（细胞裂解
3、液），轻柔的反复颠倒混匀5-6 次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液4 ）加入350ul溶液皿（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6 次，此时会出现白色絮状沉淀5 ） 12000室温离心10min，收集上清6 ）将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min7 ） 12000转离心1min，弃滤液8 ）加入500ul溶液PB （洗涤液）12000转离心1min，弃滤液， 目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒 DNA9 ）加入500ul溶液W （去盐液），12000转离心1min，弃滤 液，重复一次10 ） 12000转离心3min，以彻底去除纯化
4、柱中残留的液体11 ）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50-100ul溶液 Eluent （为无菌的双蒸水，PH为8.0-8.5 ），室温放置2min12 ） 12000转离心1min，此时管底即为高纯度的质粒DNA，质 粒于-20弋保存质粒提取步骤：吸取液体培养基于1.5ml离心管中12000转离心 1mi n,弃上清，吸取培养基重复离心弃上清离心，留取少量菌液作为 菌种保存，可直接置于-20C加250ulBufferS1悬浮细菌，悬浮 均匀一加250ulBufferS2温和充分的上下翻转4-6次混合均匀，使 菌体裂解加350ulBufferS3温和上下翻转12000离心10min 取上清液转移到专用的制备管（2ml） 12000转离心1min，弃滤液 加 500ulBufferW112000 转离心 1min ,弃滤液加 500ulBufferW212000转离心1min，弃滤液，重复一遍将制备 管置回2ml离心管12000转离心1min将制备管移入新的1.5ml 离心管中，加6080ulEluent或离子水，室温1min 12000转离心 1min移去制备管，将有质粒的离心管于4C或是-20C保存。
