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1、一种聚丙烯酸接枝型荧光纳米粒子的制备、性能及细胞成像摘要将N氨基4N甲基哌嗪1, 8萘酰亚胺（AMN）通过酰胺化反应接枝到聚丙烯酸链上，利用生成的聚合物在水溶 液中的自组装，制备了一种水溶性荧光纳米粒子（ PAAMN）。 采用紫外可见光谱、核磁共振氢谱、透射电镜、动态光散射 和荧光光谱方法对PAAMN进行了表征，MTT法检测其细胞相容 性，最后用荧光显微镜观察其自身荧光及细胞成像效果。实 验结果表明，PAAMN为球状结构，萘酰亚胺荧光团的摩尔取代 度为4.1%；在生理pHl件下，以390nm为激发波长，PAAMN 在534nm处发射较强的荧光，且光稳定性较好；在pH40 10.0范围内，其荧光
2、波长无明显变化，荧光强度随pH值增大 而逐渐减小，但pH敏感程度小于AMNO PAAMN具有良好的细 胞相容性，能进入细胞，且在390nm激发光下发射绿色荧光，可用于细胞成像。关键词荧光纳米粒子；聚丙烯酸；萘酰亚胺；自组装；细胞成像1 引言荧光纳米粒子是一类重要的纳米功能材料，在细胞成 像、疾病诊断及生物传感等领域有广阔的发展前景1， 2， 而具有良好水溶性、光稳定性及低毒性是其在这些领域中应 用的前提。目前，基于无机材料的荧光纳米粒子研究较为广 泛，如无机半导体量子点3、碳量子点4和金纳米粒子5 等，这些纳米粒子常需要通过表面修饰或者聚合物包覆来提 高其水溶性、可修饰性、生物相容性等特性。相
3、对于无机荧 光纳米粒子，有机聚合物荧光纳米粒子在结构多样性和功能 可设计性方面具有明显优势，近年来引起了研究者的兴趣 610。聚合物纳米粒子中荧光团的存在形式主要有两种 11， 12 、一种是非共价结合，如在纳米粒子制备过程中或者制备完成后，通过包埋或吸附方法负载荧光团；另外一种 是共价键合，如通过表面修饰方式将荧光团键合到无荧光的 纳米粒子上，或先制备荧光聚合物单体，再聚合形成纳米粒 子。利用生物相容性两亲聚合物的自组装对荧光团进行包裹 是制备荧光聚合物纳米粒子的常用方法11，13，14，该方 法简单，得到的纳米粒子水分散性及生物相容性良好，但由 于荧光团以非共价方式结合，在使用过程中容易泄
4、露。采用先将荧光团与聚合物共价结合再进行自组装的方法可以减少 或避免染料泄露问题，有效提高荧光纳米粒子的稳定性，目 前该类水溶性荧光纳米粒子的研究报道较少1517。聚丙烯酸（PAA）是一种常用高分子材料，在化工、纺 织、水处理、食品、医药等领域应用广泛18，19。由于 PAA 无毒、易溶于水，且富含可功能化的羧基，近年来被研究者 用于无机纳米粒子的修饰制备有机无机复合纳米材料20， 21、与共价聚合物进行自组装制备水溶性荧光纳米粒子 22、作为两亲聚合物的亲水链段制备纳米胶束23、进行 交联制备纳米凝胶24等研究。本研究采用 1， 8萘酰亚胺荧 光化合物N氨基4N甲基哌嗪1, 8萘酰亚胺（AM
5、N）对PAA进 行接枝改性，制备了两亲性的荧光聚合物，并利用该聚合物 在水溶液中的自组装得到了一种新的荧光纳米粒子（PAAMN）；对其形态、结构及荧光特性进行了表征，并考察 了其细胞毒性及细胞成像能力。结果表明，此纳米粒子具有 好的水溶性、光稳定性和细胞相容性，可进入细胞并发射绿 色荧光，在细胞成像方面有良好应用前景。2 实验部分2.1 仪器与试剂BrukerAV400 型核磁共振仪（瑞士 Bruker 公司）； UV2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；320S型pH计 （梅特勒托利多仪器有限公司）；F4600型荧光分光光度计 （日本日立高新技术公司）；JEM100CXII型透射电镜TE
6、M （日本电子株式会社）； IX51 型倒置荧光显微镜（奥林巴斯株式会社）；ST360型酶标仪（上海科华生物工程股份有限公 司）； ZetasizerNanoZEN3600 型动态光散射纳米激光粒度仪（英国 Malvern 公司）。AMN的合成见文献25;聚丙烯酸（PAA,分子量2.6 万，河南凯特化工有限公司）； Gibco 胎牛血清及 DMEM 培养 基（ Invitrogen 公司）； 3（ 4， 5 二甲基噻唑 2） 2， 5 二苯 基四氮唑溴盐（MTT，Sigma公司）；HeLa细胞为实验室传代 培养；其它试剂均为市售分析纯；实验用水为去离子水。2.2PAAMN 的制备将 0. 5g
7、PAA，0. 63gEDAC?HCl 和 0. 79gNHS 溶于 10mLDMF 中，在室温下搅拌反应1h,向其中加入含AMN的DMF溶液， 并于60C搅拌反应4h。将反应液离心，上清液放入透析袋 中，在pH34的稀HCl中进行透析。透析一段时间后将袋内 胶状固体取出，溶解在pH11的NaOH溶液中，滴加稀HCl使 其析出。经过多次碱溶酸沉处理后，将该固体溶解，再于水 中透析，测试透析液荧光强度。当透析液荧光强度为零时， 将透析袋内溶液取出，冻干，得目标产物（PAAMN）。2.3PAAMN 的形态及结构表征 将纳米粒子溶液滴在含有 Formar 膜的铜网上，并进行负 染，采用TEM观察其形态
8、；采用纳米激光粒度仪测定PAAMN 在水溶液中的粒径；用DMS0d6+D20为溶剂测定PAAMN的1HNMR 光谱。将AMN溶于乙醇中，配成l0mg/mL储备液，再用水稀释 得所需浓度的工作溶液。将 PAAMN 用水溶解，配制成2.0mg/mL 储备溶液，并用水稀释至所需浓度的工作溶液。分 别测定AMN及PAAMN工作溶液的紫外可见吸收光谱；在392nm 下测定不同浓度 AMN 溶液的吸光度并绘制标准曲线。根据PAAMN溶液在392nm处的吸光度和AMN的标准曲线，按文献 25的方法计算纳米粒子中荧光团的摩尔取代度。2.4 荧光性质研究荧光光谱及量子产率测定、测定水溶液中PAAMN及AMN 的
9、荧光光谱；以硫酸奎宁为参比，测定水溶液中PAAMN及AMN 的荧光量子产率，硫酸奎宁在005mol/LH2S04溶液中的量子 产率按0.55计算26。光稳定性考察、以390nm为激发波 长，534nm为发射波长，每隔5s测定一次PAAMN溶液的荧 光，观察 2.5h 内荧光强度的变化。金属离子对PAAMN荧光的影响、分别移取PAAMN的工作 溶液01mL和Ph74的磷酸盐缓冲溶液50mL加入到100mL 比色管中，再加入金属离子；以不加金属离子的PAAMN体系 作为对照。各溶液用水定容后测定荧光光谱，记录荧光强 度。pH值对PAAMN荧光的影响、分别移取PAAMN及AMN的工 作溶液01mL加
10、入到100mL比色管中，用不同pH值的磷酸 盐缓冲溶液定容后测定荧光光谱，记录荧光强度。25MTT 法检测细胞相容性将对数生长期的HeLa细胞按每孔5000个细胞接种于96 孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM为培养基，在37含 5%C02 的培养箱中培养。待细胞贴壁后，吸去板内培养基残 液，加入含不同浓度PAAMN的培养液，置于培养箱中孵育 24h，此后向每孔加入20 uL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继 续孵育4h。然后移去板内液体，每孔加入200ULDMS0,将细 胞培养板放置摇床上，低速振荡使结晶物充分溶解。用酶标 仪在490nm波长处测量各孔的吸光度（A）。以未加PAAMN的 细胞
11、作空白对照，计算细胞的相对增殖率（Relativegrowthrate，RGR）、RGR二（A 实验组/A 空白对照 组）X100%。26 纳米粒子及染色细胞的荧光显微成像纳米粒子的荧光观察、将01mg/mLPAAMN溶液用PBS溶 液（pH74）稀释10倍，然后取01mL置于24孔培养板中， 于荧光显微镜下观察。细胞染色及成像、将HeLa细胞接种于24孔培养板中， 待细胞贴壁后，移去原培养基，加入含001mg/mLPAAMN的新 培养基，并置于C02培养箱中于37C下培养2h。然后移除培 养基，用PBS溶液将细胞洗涤3次，再加入4%的多聚甲醛固 定细胞，最后用荧光显微镜观察细胞成像效果。3
12、结果与讨论3.1PAAMN的制备与表征PAAMN的制备方法如图1所示。PAA中的羧基被活化后与AMN中的氨基反应，形成接枝聚合物；该聚合物在透析过程中 发生自组装形成纳米粒子，未反应的荧光团和溶剂也在透析 中除去。将透析纯化后的纳米粒子溶液冻干，得到PAAMN。固 体 PAAMN 能溶解于水中形成黄色透明溶液。采用TEM、动态光散射（DLS）、UVVis及1HNMR方法对 纳米粒子的形态及结构进行了表征。TEMD如图2A所示，纳米 粒子呈规则球状颗粒；如图2B所示，DLS测定PAAMN的水合 粒径约为 290nm。图3为AMN和PAAMN的UVVis光谱，AMN的最大吸收峰在392nm, PA
13、AMN的最大吸收峰在394nmo 1HNMR测定表明， PAAMN在7. 00877ppm处有明显的芳环氢相关信号，且在 2.530ppm处有哌嗪环上亚甲基的相关信号（图4）。由于PAA在300nm以上无明显的吸收峰，其结构中不存在芳环，而纳米粒子中未与PAA键合的荧光团已通过透析除去，因此上 述结果证明萘酰亚胺荧光团已经被固定于PAAMN中。经计 算，荧光团的摩尔取代度为4. 1%，说明PAA中仅有部分羧基 被取代，生成的纳米粒子中仍有大量可修饰的羧基存在，为 其进一步功能化提供了条件。3.2 荧光性质由 AMN 和 PAAMN 的荧光激发和发射光谱（图 5）可见， PAAMN 具有与 AM
14、N 类似的特征荧光光谱，它们的最大激发和发 射波长均分别为390和534nm，说明PAAMN的荧光是由萘酰亚 胺荧光团产生，且与PAA链键合对荧光团的荧光波长无明显影响。水溶液中PAAMN和AMN的量子产率测定结果分别是 0.14和0.08，说明形成纳米粒子增强了萘酰亚胺荧光团的荧 光。在设定的测试条件下，25h内测定PAAMN的荧光强度变 化在 7%以内（图 6），说明其有较好的光稳定性。金属离子对PAAMN荧光强度影响的实验结果表明，在生 理 pH 条件下，1.0106mol/L 的 Mg2+，Hg2+，Ni2+, Mn2+， A13+, Zn2+, Ba2+, Ag+和Cd2+对PAAM
15、N的荧光没有明显影响 ex=390nm；em=534nm.由于许多4氨基萘酰亚胺衍生物对pH敏感27, 28，因 此本研究进一步考察了 pH值对PAAMN荧光性质的影响。结果 表明，在pH4010.0范围内，PAAMN的最大激发和发射波长 不随pH值变化而变化，但荧光强度随着pH值增大而逐渐减 小。如图7所示，PAAMN的这种pH调控荧光分子开关功能与 AMN类似，但荧光强度变化趋势及范围要小于AMN。造成上述 现象的原因可能是28， 29、碱性条件下，萘酰亚胺类化合物哌嗪基团中的烷基胺作为电子给体，向萘酰亚胺进行光致 电子转移（PET），从而淬灭萘酰亚胺的荧光；酸性增加使哌 嗪基上的氮原子发
16、生质子化，抑制了 PET过程，因此荧光强 度增强；与AMN相比，PAAMN中有较多的羧基，对哌嗪上氮原 子的质子化具有一定的缓冲作用，因此其荧光强度随pH值变 化相对较小。3.3 细胞相容性用于生物样品的纳米材料应具有良好的生物相容性。细 胞毒性试验是体外评价纳米材料生物相容性的常用方法，具 有经济、快速、操作方便等优势。本实验采用MTT法考察了 PAAMN浓度（0.001025mg/mL）对HeLa细胞增殖的影响， 并根据美国药典中RGR与细胞毒性分级的关系（RGRM100%为0级；80%99%为I级；50%79%为II级；30%49%为III级； 029%，W级）对其毒性进行评级。从图8可见，在测定的 浓度范围内
