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1、宜宾学院YIBIN UNIVERSITY 本科毕业论文（设计）毕业论文题 目： 油樟DNA提取的研究 专 业： 生 物 科 学 学生姓名： 学生学号： 030601023 系 级 班： 生物工程03级1班 指导教师： 职称: 教 授 宜宾学院教务处制 摘要油樟是樟科樟属植物，本课题主要研究油樟根茎叶DNA的提取方法以及对根茎叶DNA提取效果进行对比分析。油樟的细胞内含有大量的多糖、多酚、鞣质等次生代谢物,针对这一情况本研究在常规CTAB法的基础上做了进一步改进，成功提取出了高质量DNA。做的改进主要有：在CTAB提取缓冲液中加入2gPVP以除去酚类杂质；将DNA样品溶于TE缓冲液中保存时在样品
2、中加入3lRNaseA，以除去RNA。用改进CTAB法提取的DNA得率和纯度都较高。用改进CTAB法提取的油樟根DNA得率小于油樟茎DNA的得率小于油樟叶DNA得率，由于植物各组织器官的基因组DNA是相同的，因此宜用更易研磨成细粉的油樟嫩叶来提取油樟DNA，用做科研和教学。关键词：油樟；DNA；CTAB（十二烷基三甲基溴化铵）；电泳；光吸收AbstractCinnamomum longepaniculatum belongs to laurel family and Lauraceae species. The topics studied mainly the method of extra
3、cting DNA and compared the DNA extracting methods from roots, branches of Cinnamomum longepaniculatum . Cells of Cinnamomum longepaniculatum contain a large number of polysaccharides, polyphenols, tannins, and other secondary metabolites. Based on conventional CTAB method, a serial of improvements w
4、ere carried out and high-quality DNA was successfully obtained. The main improvements are: 2g PVP was added into CTAB extraction buffer to remove impurities phenols; 3l RNaseA into the samples when DNA samples preserved in TE buffer to remove RNA. Improved CTAB extraction of DNA yield and purity was
5、 higher. The DNA yield using improved CTAB extraction was roots stems leaves. Because genomic DNA is same, it is easier to extract DNA from leaves of Cinnamomum longepaniculatum for research.Keywords: Cinnamomum longepaniculatum; DNA; CTAB method of DNA; electrophoresis; absorbing value of light目 录摘
6、要IAbstractII第1章 绪论1第2章 油樟根茎叶DNA的提取方法31.材料、药品、仪器31.1 材料31.2主要试剂溶液31.3 主要仪器设备42.实验方法和步骤42.1 常规方法的提取42.2改良CTAB法52.3 油樟根、茎、叶DNA提取的比较方法63.结果及分析63.1 0.8%琼脂糖凝胶电泳结果及分析63.2 紫外光谱分析84.讨论104.1 CTAB法的基本原理104.2 几种主要试剂的作用与对比104.3 方法的探索及改进114.4 注意要点124.5 实验过程中遇到的问题及对策125.总结135.1135.2135.313参考文献14致谢15文献综述1619第1章 绪论图
7、1-1油樟如图1-1油樟Cinnamomum longepaniculatum (Gamble)是樟科樟属植物。高大乔木，叶互生，卵形、椭圆形或短圆形，先端长渐尖或急尖，基部楔形至近圆形，长5.5-12cm，宽3-6 cm，幼时即无毛，腹面暗绿色，有光泽，背面粉绿色，通常羽状脉，中脉两面凸起，侧脉约5-6对，两面凸起，脉腋腹面泡状隆起，背面有小窝孔，孔内有短毛，横脉和细脉背面较明显，叶柄长2-3 cm，无毛。圆锥花序腋生，纤细，疏散，通常长10 cm以上，无毛，花梗长1-3 cm，无毛；花被长约2 mm，外侧无毛，内侧密被毛，裂片卵形，长1.5 mm，花后花被上部自花被管的顶端处整齐环裂脱落；
8、雄蕊长约1 mm，被柔毛，第3轮的花丝基部有1对具短柄状的腺体，退化雄蕊长约0.5 mm，被毛，近心形；雌蕊无毛，子房近圆球形状，花柱较子房为长，柱头小，盘状。果阔倒卵状，顶端平或微凹，歪斜，稍扁，长9 mm，直径8 mm，果托碟状，全缘，直径约3.5 mm；果梗长4-5 mm，向上增粗。花期4-5月；果期8-9月1。油樟在四川有大量分布，产于叙永、宜宾、屏山、娥眉、雅安、邛崃等地。宜宾是油樟的分布中心。在经历了许多坎坷之后，油樟终于闪现出了它那金子般的光芒。1951年修建成渝铁路时，油樟被成批地砍伐用作枕木；1958年大办钢铁时，油樟竟老嫩不拘，被用作烧泡炭的燃料；1960年生活困难时，为了
9、熬煮樟油，对幸存的樟树进行了掠夺性的采摘。这些事实都导致珍贵的油樟资源招到了大规模的破坏，幸好在1978年十一届三中全会以来，各项林业政策得到了落实，油樟林也逐渐得以恢复。1978年樟油产量增长为356t，比1959年的305 t，增长16.7%。到1985年宜宾县已有油樟林35130亩，采叶油樟树达到369万余株，全县树龄达到100年以上的油樟64株，200年以上的9株。1986年宜宾县被列为四川油樟基地2，由于大力发展油樟，到1995 年，宜宾全县油樟面积由1980 年的0.28 万hm2 发展到0.77 万hm2 ，樟油产量从1980 年的400 多吨 ，增加到1995 年的1200 t
10、 ，占全国同类产品产量的75 %，占全省产量的90 %，产品畅销日本、德国、法国、美国等50多个国家和地区，为国家创汇450多万美元3。宜宾县被称为全国保存和发展最好的天然香料油源基地。樟油粗加工的主产品1. 8-桉叶油素，被称为“中国桉叶油”4，1984 年被评为四川省优质产品。1999 年，为适应西部大开发的形势，增加长江上游绿色植被，加大力度保护油樟树这一独特资源，建设全国最大的木本香料油基地，宜宾县又决定到2001 年，用3 年时间，再营造0.30 万hm2 油樟树基地。油樟树具有生长快、材质好，萌发力强、干形通直，树形美观等特点，叶、枝、根、茎、花、果富含芳香油，是提炼天然香料的优良
11、树种，也是目前全国保存和发展最好的天然香料油源。它含有18-桉叶油素、-萜品醇（松香醇）和香穗烯等40多种成分，经过深度加工可以提取多种重要的天然单离原料，是国防、轻工、香料、医药和高级电镀工业的稀有原料5。特别是从中提取的18-桉叶油素物性稳定、芳香纯正，在国际贸易中被称为“中国桉叶油”，在世界各国都属免检产品。为了充分开发利用油樟这一优势资源，国家科委于1996年将其列入了国家 “星火计划”和名特优经济林商品基地建设项目6。宜宾县地处金沙江和岷江下游“金三角”地带，是全国最大的油樟基地，樟油产量占全国的75%，占四川的90%，被中外客商誉为“油樟王国”。大力发展油樟，对农民致富、出口创汇、
12、增加税收、绿化荒山以及维持长江上游的生态环境等都起着十分重要的作用。我们学校已经建立了以油樟为主要研究对象的“西南特色经济植物重点实验室”，为了从分子水平上对其做进一步的研究，本课题开始了初步的尝试，目的是为以后的分子生物学分析打下基础。第2章 油樟根茎叶DNA的提取方法由于DNA分子标记实验以及其他许多分子实验，是从研究生物个体的基因组，脱氧核糖核酸开始的，因此，能否得到高质量的基因组DNA自然成为DNA标记技术关键的一步，只有高质量的DNA，才能够获得理想的DNA条带。油樟的细胞内含有大量的多糖、多酚、鞣质等次生代谢物。这些次生代谢产物, 不仅能干扰DNA 的提取过程, 影响DNA 的得率
13、, 还能与DNA 发生不可逆的结合(尤其是多酚氧化后产物) , 影响DNA 的质量, 使提取的DNA 样品呈棕褐色, DNA 溶液粘稠, 这种不纯的DNA 既不能被内切酶酶切, 也不能作为PCR 模板, 不能用于常规的分子生物学分析和研究7 。因此, 如何从油樟中取得适于分子遗传分析和鉴定的高纯度基因组DNA 是对其进行分子生物学研究首先要解决的问题。虽然目前国内外针对多种顽拗植物基因组DNA 的提取进行了大量的研究, 提出了许多改进方法, 但这些技术方法只是针对某种或某类植物而言, 不同的顽拗植物所含的次生代谢物种类和含量不同, 因此改进的方法也存在差异, 不能普遍适用。要想得到高质量的DN
14、A，在DNA提取过程中既要防止DNA的降解和变性，又要尽量保持其在生物体内的天然状态。要提取天然的具有生物活性的DNA，必须在温和的条件下，防止过酸、过碱和DNA酶的污染，避免剧烈振动与搅拌8。采用常规CTAB法提取的油樟基因组DNA 质量很差,本研究就以油樟的根、茎、叶为实验材料,探讨提取高质量油樟基因组DNA 的方法。1.材料、药品、仪器1.1 材料采于宜宾县宗场镇孜岩村陆场主承包的油樟林，采取了幼嫩的油樟根、茎、叶，装入1.5mlEppendorf管和5ml离心管，立即置液氮罐中预冷，带回实验室后，保存于-70的冰箱中备用。1.2主要试剂溶液1.2.1 液氮;1.2.2 CTAB提取缓冲
15、液（2）：100mmol/l Tris-Hcl(PH8.0),20mmol/l EDTA,1.4mmol/lNacl,2%(W/V)CTAB,4%(V/V)-巯基醇,2%(W/V)PVP;1.2.3 CTAB沉淀缓冲液（1）：50mmol/l Tris-Hcl(PH 8.0),10mmol/l EDTA,0.7mmol/lNacl,1%(W/V)CTAB,2%(V/V)-巯基乙醇;1.2.4 CTAB/Nacl溶液（10%CTAB/0.7mol/lNacl）:在80ml蒸馏水中溶解4.1gNacl,缓慢加入10gCTAB,同时加热搅拌，如果需要，可加热至65溶解9;1.2.5氯仿/异戊醇（24：1）;1.2.6电泳缓冲液（TAE）：A)50储存液（PH约8.5）:24.2gTris碱,5.7ml冰醋酸，3.72gEDTA,补加
