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1、ELISA 技术的质量把握标签： ELISA 分类： 临床工作 2023-0725 15：15ELISA 简介：酶联免疫吸附试验Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay， ELISA于 1971 年分别由瑞典学者和荷兰学者报道，开创了运用酶标记免疫技术进展液体标本中微量物质测定的试验方法.根本原理是把抗原或 抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体外表，测定时，将受检样品含待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体按确定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反响形成抗原或抗体复合物,经洗涤去除反响液中其他物质，参与酶反响底物后，在酶的催化下变为有色物质，最终通过定性或定
2、量分析有色产物量即可确定样品中被测物质量。此方法具有高度的敏感性和特异性，酶标试剂比较稳定,且易于自动化，因此应用格外广泛,几乎全部的可溶性抗原抗体系统均可使用，我 室开展的肝炎病原学检测、HIV 抗体检测、梅毒抗体检测等都使用 ELISA 方法。ELISA 质量保证是一个简洁的过程,很多重要的环节都影响到检测的质量。一、方法学的影响ELISA 测定模式包括以下几种：双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM 抗体捕获法、竞争抑制法，其中竞争抑制法(HBeAb，HBcAb 等承受因受操作时差所引起的不公正竞争等因素的影响,结果重复性较差，质量较难把握。二、试剂因素不同批次的 ELISA 试剂在
3、制作过程中很难保证质量完全全都,即使是通过批批检的工程其检测结果也存在差异，因此必需选择和订购长批号的试剂，并保证保存条件。严格执行这一标准可以避开因试剂批号转变而重建立质控体系及重评估试剂的简洁过程，并且能够 保证结果的稳定性；对于效期短、使用率低的试剂，应当小量分装，每次使用则取分装局部即可，避开反复冻融造成试剂的失效。试剂使用前必需平衡至室温，否则会影响检测下限。未用完的室内质控品及本次不需使用的试剂应密封并准时放回冰箱保存。 三、样本因素标本干扰因素包括内源性干扰因素和外源性干扰因素，前者包括类风湿因子、补体、异嗜性抗体、自身抗体、溶菌酶等 ,后者包括标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存
4、时间过长、标本凝固不全、冷冻标本的反复冻融等.其中外源性干扰因素是我们在检测过程中可以避开也 是必需避开的因素，而避开内源性因素的干扰则主要通过选择适宜的试剂盒。在临床中遇到少见的疑难病例时应当考虑到内源性干扰因素的存在。以下对外源性干扰因素进展简要说明:1.标本溶血 要留意避开消灭严峻溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其具有类过氧化物的活性，因此，在以辣根过氧化物酶horseradishperoxidase,HRP)为标记酶的 ELISA 测定中，假设血清标本中血红蛋白浓度较高,则其就很简洁在温育过程中吸附于固相,从而与后面参与的底物反响显色。2。标本被细菌污染 标本的采集及血清分别要留意尽量
5、避开细菌污染。细菌菌体中除可能含有内源酶对测定产生非特异性干扰外，还可能对抗原抗体等蛋白产生分解作用。另外标本在保存中消灭浑浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。3。标本贮存时间过长 标本在低温下保存时间过长，IgG 可聚合成多聚体，在间接法 ELISA 测定中会导致本底加深、甚至消灭假阳性结果。通常状况下血清标本可在 28下保存 l 周，冷冻保存时间会更长，但对于抗体或抗原含量低的标本而言，则可能会因抗体掉价、抗原分解而消灭假阴性结果。4.标本凝固不全 血液通常在采集后半小时后开头凝固， 1824h 完全凝固。假设在血液未凝固时即离心分别血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果
6、。为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者承受带分别胶的采血管或 于采血管中参与适当的促凝剂以加速血清的分别。5。冷冻保存标本避开反复冻融 标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作屡次检测，宜少量分装冻存。此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均， 因此重融解的标本必需混匀，但不要进展猛烈振荡，反复颠倒即可。四、操作因素对 ELISA 结果的影响ELISA 操作步骤简洁，操作不当将引起较大的误差。以下表达各个步骤中的影响因素。1。加样加样器是一种比较周密的工具,其在长时间
7、使用时会因机械磨损或者推动杆内附着血痂等缘由造成加样不准，尤其是对于样本量较大的临 床试验室,因此必需定期对加液器进展维护和校准。每次加不同的标本时均需更换吸嘴，以免发生穿插污染。加样时速度不行太快，避开将标本加在孔壁上部 ，并留意不要溅出或产生气泡，产生气泡可以削减标本与包被物的接触,降低试剂的敏感性。不要让吸头接触孔底部,以防破坏包被物，吸附血清内的蛋白，造成假阳性。加样时还应当留意操作时差对结果的影响,操作时差是指参与标本、试剂及混匀时间的差异。操作时差在每个试验中都存在，尤其是手工操作,日常检测标本多达几百个，从参与第一个标本到最终一个标本，需几格外钟，参与试剂及混匀等均存在着前后的时
8、间差异，使抗原抗体反响和酶促反响时间不全都，操作时差对竞争法检测的结果影响更大，在加酶结合物和底物时可用定量多道加液器，使加液过程快速完成。假设使用滴瓶除留意滴加的角度外还要留意滴加的速度，速度太快，简洁消灭重复滴加或者加在两孔之间，造成非特异性吸附。 另外有些工程在检测前需要稀释以减低非特异性反响，但稀释的方式格外重要,假设承受手工稀释则简洁因操作者个体差异而产生不全都 的结果，尤其是吸光度处于临界值四周的标本，因此最正确的方式是承受振荡器混匀。2.温育在 ELISA 检测中一般有两次抗原抗体反响,即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反响的完成需要有确定的温度和时间，这一保温过程称为温 育(in
9、cubation)。温育常承受的温度有 43、37、室温存 4(冰箱温度等。37是试验室中常用的温育温度,也是大多数抗原抗体结合的最适反响温度。有试验说明，抗原抗体反响一般在 37经 12 小时产物的生成可达顶峰.为加速反响,可在确定范围内提高反响的温度并在反响过程中连续振荡以增加抗原抗体接触的时机.抗原抗体反响在 4反响更为彻底，形成的产物更多更稳定，但因所需时间太长，在 ELISA 检测中一般不予承受。温育的方式有温箱法、微波辐射法、水浴法等，其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的四周孔与中心孔结果的吸光度差异这种现 象被称为“边缘效应”).假设用温箱温育则 ELISA 板应放在湿盒内，湿
10、盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最终将ELISA 板放在湿纱布上。承受这种温育方式的关键是必需保证湿盒内的温度到达反响的要求，可在反响前将湿盒预温至规定的温度，并用温度计监测反响过程。承受水浴时，将 ELISA 板置于水浴箱中，板底贴着水面。为避开蒸发，板上应加盖或用塑料贴封纸或保鲜膜掩盖板孔，此时可让反响板漂移在水面上。温育过程中，反响板不宜叠放，以保证各板的温度都能快速平衡。严谨的 ELISA 试剂盒一般都规定了明确的温育温度，假设要求室温温育，则一般是指 2025。微波辐射法能缩短温育时间，但不能解决“边缘效应”，因而较少使用。3.洗涤洗涤是 ELISA 测定过程中打
11、算试验成败的一个关键步骤.其目的是去除反响体系中与反响无关的成分、未结合的酶结合物以及反响过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。由于抗原和抗体的包被通常是在碱性条件下与固相的疏水键相互作用而被动吸附于其上的，因 此必需留意非离子去垢剂的使用浓度，最常用的洗涤液是含 0.05吐温 20 的 0.02mol/L， pH 为 7.4 的 PBS 液，假设洗涤液中的吐温 20 超过 0.2,可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而影响试验的测定下限。洗涤可承受洗板机或手工洗涤两种方式，手工洗板则分为浸泡式和流水冲洗式洗涤.无论洗板方式如何，在向板孔内注液时应当避开气泡 残留孔内，否则会因洗涤液难以进入孔
12、中而影响洗涤效果.在承受洗板机洗板时，确定要将板条平放于板架上,保证洗板机上的每个吸液针 都能全都地插入板孔底部将洗液完全吸净，否则空白值将上升甚至消灭“花板”现象背景不干净，造成试验失败，尤其是当酶结合物 非特异吸附而残留于板孔时。假设承受手工洗板,则可在每次弃去板孔内液体后将反响板于布料上拍干，布料可在消毒洗涤后重复使用.手工洗板一般为 35 次，使用洗板机洗板时，其所需次数可通过以下试验确定：选择 812 HBsAg ELISA 包被板条，在每孔中平行参与一样的一份弱阳性血清，按试剂盒说明参与酶结合物并完成温育，洗板机设置如下：第 1 次洗涤 1 排、第 2 次洗涤 2 排、第 3 次洗
13、涤3 排直至 8 次洗涤 8 排，每次只洗涤 1 遍，其结果是第 1 排洗涤了 8 遍，第 2 排洗涤 7 遍第 8 排洗涤 1 遍,加底物显色后,依据吸光度值不再转变的反响条的洗涤次数来确定最正确的洗板次数,例如第 3 排反响条吸光度值不再转变，则认为该工程最正确洗涤条件为 6 遍。另外有三方面必需留意:一是在使用洗板机洗板时,通常在上机前应先将反响液弃去并用流水快速冲洗 1 遍，避开因反响液对洗板机管道污染而造成的穿插污染和背景颜色加深，但对于粘性大的稀释液或反响液而言，则需直接上机洗涤,并增加洗板后清水冲洗管路的次数； 二是对于两步法而言第一步洗涤次数不宜太多，否则将降低结果的吸光度值。
14、4. 显色显色是 ELISA 中的最终一步温育反响，在以 HRP 作为标记酶的 ELISA 试剂盒中，主要承受 TMB 和 OPD 两种底物，其中以 TMB 最为多见，TMB 底物显色一般要求室温或 37反响 1530 分钟.争论说明，显色受时间和温度的影响，一般37反响 30 分钟可使显色充分，假设缩短反响时间或者降低反响温度均可影响检测的下限。为了保证结果的稳定性,必需固定显色时间和温度，但不少操作者往往忽 略了这一点.TMB 显色体系的 A 液和 B 液可在使用前先混合然后用排枪参与反响孔中，这样既节约人力又缩短了操作时差对结果的影响。反响液应颖配制并且避开接触金属器皿，否则可因氧化等缘
15、由产生颜色反响 .OPD 由于其具有致癌性目前已很少使用。5. 比色ELISA 显色的结果必需通过酶标仪进展检测，有两个重要的缘由:一是不同的个体的色觉存在差异，假设仅凭肉眼推断，则结果重复性差， 并且难以形成统一的推断标准，尤其是对于 HBeAb、HBcAb 这样的检测工程；二是日益频繁的医疗纠纷要求临床试验室必需对 ELISA 检测的原始吸光度值，阴阳性推断结果等原始数据进展保存，否则面对医疗纠纷时将无法举证。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠 SDS等酶抑制剂均可使反响终止,各类酸性终止液则将蓝色转变成黄色。有试验表明，从终止反响后 2 分钟开头，样本的吸光度值渐渐下降，起始
16、吸光度值越高其下降速度越快，为保证明验结果的稳定性，宜在终止反应后 2 分钟内读取吸光度值。酶标仪应承受双波进步行测定,必需包括对颜色产物敏感和不敏感的两个吸取峰波长，在非敏感波特长测定特异性显色的吸光度值接近为 零，此时测的吸光度值为容器上的划痕、指印、背景等造成的光干扰。以 TMB 底物为例，其最大吸取的波长为 450nm，非敏感波长为630nm，双波长检测最终得到的吸光度值为两者之差。双波长测定能去除背景的干扰，一般不设空白孔，否则会消灭吸光度值为负值的现象。酶标仪的使用需强调仪器的维护和保养，酶标仪首先应放置通风处,避开机器内部尤其是滤光片发霉，在使用过程中避开酸等物质溢出腐 蚀仪器，每半年或一年请计量局对酶标仪进展检定，并请厂商定期
