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1、双向凝胶电泳技术原理与应用Principle and application of two-dimensional gelelectrophoresis姓名：XX班级：检验本科1113 班学号： XXX【摘要】 人类基因组计划与美国塞莱拉遗传信息公司于2001 年在美国科学 杂志和英国自然杂志联合宣布，他们绘制出了准确、清晰、完整的人类基因 组图谱，至此，人类基因组计划已基本完成，随着后基因组时代的到来，蛋白质 组学得到了空前的发展，蛋白质组研究旨在揭示基因表达的真正执行生命活动的 全部蛋白质的表达规律和生物功能。包括蛋白质组、蛋白质组学、功能蛋白质组 学和结构基因组学等新的概念的提出，蛋白质
2、组学已成为当今生物领域中极其活 跃的学科。其中双向电泳(two-dimensional electrophoresis, 2.DE)是蛋白 质组研究的三大关键核心技术之一【 abstract 】Human gene group plans and United Statessailaila genetic information company Yu 2001 in United States Science under magazine and United Kingdom natural under magazine joint announced, they draws out has
3、accurate,andclear,andcompleteofhumangeneGroupmap,atthispoint, human gene group plans has basic completed, as Hou gene group era of comes, protein group learn get has unprecedented of development, protein group research aimed at reveals gene express of real implementation life activitiesofallproteino
4、fexpresslawandbiologicalfunction.Includes proteome, proteomics, structural proteomics and functional genomics of new concepts, such as proposed, proteomics has become extremely active inthefieldofbiologicalsciences.Two-dimensionalgelelectrophoresis (two-dimensional electrophoresis,2.DE) is one of th
5、e three key core technologies of proteome research【关键词】双向电泳；蛋白质组学； 后基因组时代【key words 】two-dimensional electrophoresis, 2.DE proteomics Post-genomics era【前言】由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重要性质，而2.DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差异分离蛋白质，因此2.DE的分离能力 非常强大，它甚至能将细胞中的5000种蛋白分离开，2.DE在分离蛋白混合样品、 比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查明大型蛋白复合物各组
6、 组分，与其他生物技术如分子生物学、分子遗传工程、免疫学、微量蛋白质的自 动氨基酸序列分析相结合，可以快速准确地发现和鉴定新的蛋白质。【荧光定量PCR的基本原理】【1-3】双向电泳由于具有高分辨率和高灵敏度已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具1。自1975年OFarrel等 建立这种技术后，已有许多改进，使得 这一技术日趋完善。2-DE是利用蛋白质的带点性和分子量大小的差异，通过两 次凝胶电泳达到分离蛋白质的技术。第一向电泳是依据蛋白质的等电点不同，通 过等电聚焦电泳(isoelec-tricfocusing，IEF)将不同净电荷的蛋白质在PH 梯度介质中外加电场作用形成分离的蛋白质区带。然后将
7、凝胶包埋在SDS-PAGE 凝胶板上端，根据蛋白质分子量的不同，在垂直或水平方向进行十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，即第二向电泳;在IEF中，蛋白质因等电点 不同而被分离;在SDS.PAGE 中,不同分子量的蛋白质相互间被分离开，再用考马 斯亮兰或银染进行检测3 ，经 Pdquest 等软件对结果进行比对、解析。【双向电泳技术应用过程中的关键步骤】1、样品制备(蛋白提取)(1) 细胞培养、处理和收集;(2) 将细胞在IEF裂解缓冲液中溶解；蛋白质的溶解常米用含有8mol/L尿素、4%3-(3-胆胺丙基)-丙磺酸 (SHAPS)、50100mmol/L DTT和40mm
8、ol/L Tris的样品缓冲液。样品溶解得不 好会减少 分离到的蛋白质数量，同时会造成等电聚焦时某些蛋白质的沉淀，从 而减少转移到第二向电泳的蛋白质数量。(3) 将样品离心以去除不溶的细胞碎片和DNA，提取上清，-80C保存。2、蛋白质定量和上样(1) 第一向电泳等电聚焦；目前广泛采用的是固相pH梯度(immobiline pH gradient，IPG)水 平等电聚焦。常用固相PH梯度-道尔顿双向电泳法(isoelec trie point-dalton,ISO-DALT)。IPG胶的制备主要是利用不同PK固定化电解质的组 合可配制不同PH范围的凝胶。(2) IPG的平衡；由于第一向电泳的缓
9、冲液系统与第二向电泳的缓冲液系统完全不同， 因此，胶条由第一转移到第二之前，必须进行平衡。平衡过程分两步：第一步平 衡液的成分主要是Tris缓冲液、SDS、DTT、尿素和甘油。平衡的主要作用是使 第一向胶体上的蛋白质变性。平衡液中的尿素和甘油可以增加溶液的粘度，减少 由固相化的两性电解质造成的电内渗。SDS用于变性蛋白质，使蛋白质带上负电。 DTT是为了在蛋白质与SDS充分结合的同时，二硫键液得到还原；这对第二向 SDS-PAGE来讲是十分重要的。第二步平衡液是用碘乙酰胺代替DTT。IPG胶条的平衡目的主要是进行蛋白质的烷基化以及让电泳介质达到与第二向SDS-PAGE相 同的缓冲体系。（3）第
10、二向 SDS-PAGE;由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了 天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差 异，均带有相同密度的负电荷，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决 于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基的分子量大小。（4）蛋白质检测用考马斯亮兰染色或银染色。银染法是通过将胶浸泡于含阴离子的溶液内，然后洗掉胶面上非紧密结合的 金属离子，加入某些试剂使与胶内蛋白结合的银离子形成金属银来显色。效果如 下图：蛋白质组谱呈满天星状（蛋白质双向图谱中每个点代表样本中的一个 或数个蛋白质，根据Cartesin坐标系统，从左到右显示的是PI的
11、增加，从下到 上显示的是分子质量的增加）3、图像分析及数据处理 将染色后的凝胶放在GS.710光密度扫描仪上，扫描后的图像用PDQUEST2.D 软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑点进行比较。IPG的优点（1）pH梯度稳定、聚焦准确、精度高；（2）无阴极漂移及碱性蛋白丢失的 现象；（3）蛋白上样量大，可提高低含量成分的分辨效果；（4）样品中盐的干扰 少，无边缘效应；（5） pH梯度、分离结果重现性好。在双向电泳应用中所面临的问题许多疏水性蛋白质(如膜蛋白)不溶于样品缓冲液，相对分子质量过大 (200X 10 3 )，极端酸性或碱性蛋白在电泳过程中易丢失，2.DE不能分辨。 低含量组分易被高含量组
12、分遮蔽，降低了分辨率。蛋白在提取和消化过程中的丢 失、凝胶的污染、在不影响分辨率情况下的上样量多少等都是尚待解决的问题。双向电泳在医学研究中的应用【5-15】1人类疾病的蛋白质组研究(1) 直肠癌 直肠癌的发生是一个多基因突变导致抑癌基因失活、癌基因活化 的过程。Sanchez等 对15例结肠癌和13例正常人的结肠上皮进行2.DE，结 果发现在相对分子质量为13000和等电点(PI)值为5.6处的蛋白质仅出现在结 肠癌的组织中。其中15例患者的癌细胞中有13例13000.PI5.6蛋白有上调趋势(87%)。此外，发现此种蛋白不仅在中度、低度分化的结肠癌及有24年病史的 溃疡性结肠炎过度表达，而
13、且出现在7例分化程度不同腺瘤的癌前病灶中，但对 照组则很少出现，这表明该蛋白的出现对检测早期直肠癌有重要临床意义。(2) 肝癌Peter等在用N.甲基.N.亚硝基脲诱导的小鼠肝癌中，用2.DE及氨 基酸微型测序可分辩出肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质(35X 10 3 .PI7.4)， 此种蛋白质在肝癌、胎肝中有高表达。经免疫组化证实，肝癌诱导的醛糖还原酶 样的蛋白质在成人肝脏中不表达，但在小鼠的肝癌中又重新表达，同时发现该蛋 白在癌前病变及肝癌中表达强烈，而在肝脏周围的正常组织不表达，表明 该蛋白可能与肝癌的发病有很大关系。(3) 膀胱癌 丹麦的一个小组利用2.DE，并结合了蛋白印迹法、微型序
14、列分 析及质谱技术分析了 150例膀胱癌病人的组织，发现角蛋白10、14及银屑病相 关的脂肪酸结合蛋白等可作为膀胱癌不同分化程度的标记物。(4) 肾癌Sarto等 在对肾癌的研究中发现有4种蛋白质存在于正常肾 组织而在肾癌细胞中缺失，其中2种分别是辅酶Q蛋白色素还原酶和线粒体泛醌 氧化.还原复合物I,这提示线粒体功能低下可能在肿瘤发生过程中起重要作用(5) 扩张型心肌病扩张型心肌病是一种严重的可导致心衰的心脏病，其发 病机制尚不明确，推测可能为多种因素所致oKnecht等 米用2.DE取得了 3300个心肌蛋白条带，通过氨基酸序列分析，Edman降解法及基质辅助的激光解吸离 子化质谱(MALD
15、I.MS)等分析了其中150条，经活检及病理检查证实，有12条 为扩张型心肌病特有的蛋白。(6) 类风湿关节炎(RA)和骨性关节炎(OA) RA是一种常见的慢性炎性关 节疾病，常侵犯多个关节，主要累及手足小关节，病情迁延反复，主要的病理 变化为关节滑膜的慢性炎症、细胞浸润、血管翳形成、软骨及骨组织侵蚀，导致 关节结构的破坏，功能丧失。而OA的基本病理改变为多种致病因素引起的进行 性关节软骨变性、破坏及丧失，关节软骨及软骨下骨边缘骨赘形成，由此引起一 系列的关节症状和体征。有研究者1。对滑膜细胞进行原代培养，应用流式细 胞仪鉴定滑膜细胞类型，提取蛋白进行双向电泳分离，比较RA与OA成纤维样滑 膜
16、细胞(fibroblastTike synoviocytes，FLS)蛋白酪氨酸磷酸化状态的差异。 结果显示:RAFLS蛋白酪氨酸磷酸化较OAFLS明显增多，其中以相对分子质量 42X10 395X 10 3间蛋白酪氨酸磷酸化位点居多，对其结果进行灰度扫描， RAFLS 灰度扫描值为 42276728947, OAFLS 为 6634807962，RAFLS 的灰度扫 描值约为OAFLS的6.5倍，两者具有非常显著性差异(T=2.820, P0.01)。1980 年Hunter11首先发现酪氨酸激酶(PTK)，许多生长因子受体都具有PTK活 性，一半以上的癌基因产物也具有PTK活性，他发现酪氨酸磷酸化比例虽小，但 却与细胞生长、增殖关系密切，很可能是正常细胞与肿瘤细胞相互转化的关键， 癌基因活化后，PTK
