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1、实验菠菜色素的提取和色素分离(extraction of pigments from spinach and chromagraphic isolation【实验目的】（1）通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；（2）通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理；（3）从菠菜中提取出叶绿素、胡萝卜素、叶黄素等色素并加以分离。【实验原理】色谱法利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。薄层色谱法是其中一种微量快速的分析分离方法。它具有灵敏、快速
2、准确等优点。薄层色谱属于固-液吸附层析的类型。通常是把吸附剂放在玻璃板上成为一个薄层，作为固定相，以有机溶剂作为流动相。实验时，把要分离的混合物滴在薄层板的一端，用适当的溶剂展开。当溶剂流经吸附 剂时，由于各物质被吸附的强弱不同，就以不同的速率随着溶剂移动。展开一定时间后，让溶剂停止流动，混 合物中各组分就停留在薄层板上显示出一个个色斑的色谱图。若各组分无色，可喷洒一定的显色剂使之显色 （如图）。混合物中各物质在薄板上随溶剂移动的相对距离称为比移值（Rf值）。溶质的最高浓度中心至原点中心的距离溶剂前沿至原点中心的距离如下图中：Rf化合物1 3.0cm12cm=0.25Rf化合物270（a）原板
3、（b）已展开层析板图薄层色谱装置图图薄层色谱效果图在一定条件下，各物质具有一定的 Rf值。不同物质在相同条件下，具有不同的Rf值。因此，可利用Rf值对物质进行定性鉴定。但物质的Rf值常因吸附剂的种类和活性、薄层的厚度、展开剂及温度等的不 同而异。所以在鉴定样品时，常用已知成分作对照试验，在同一个薄层板上进行层析，然后通过Rf值的比 较，对物质作定性鉴定。根据斑点的面积大小和颜色的深浅的标准物的对照下还可进行定量。化合物的吸附性与其极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时吸附性也较强。展开剂（溶剂）的极性越大，则对化合物的洗脱力越大，贝URf越大（如果样品在溶剂中有一定的溶解度）绿色植物如菠
4、菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。本实 验从菠菜中提取上述几各色素，并通过薄层层析进行分离。叶绿素存在两种结构相似的形式-叶绿素a （）以及叶绿素b （ CssHioOeMg ）,其差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物 进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-, 3 -和丫 -胡萝卜素，其中3 -异构体含量最多，也最重要。在生物体内
5、，3 -体受酶催化氧化即形成维生素A。目前3 -胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素 相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。ch2Ch rIIH3CMg ）N- /叶绿素a （ R = CH3）叶绿素b （ R = CHO ）【实验试剂】20g菠菜叶，20mL甲醇，40mL石油醚 （6090C）甲醇（3:2）溶液，硅胶G,ch2CHCo2ch3oCH3ch3Ji0*0ch31CHH3C CH 3* RCH3CH3CH3HsCRCH 3 门2 CH叶黃.素
6、（R = OH ）J1Fjr3 胡萝卜素（：R = H）h3c ch39Ha 9H3CH2OHCT维生素A0.5%羧甲基纤维素钠，无水硫酸钠，石油醚一丙酮（8:2），石油醚一乙酸乙酯（6:4）【实验步骤】1、薄层板的制备取四块显微载玻片，洗净晾干。在小烧杯中，放置3.0g硅胶，逐渐加入0.5%羧甲基纤维素钠水溶液67mL,调成均匀的糊状，其稀稠 为在震动下可流动，倒在洁净的载玻片上，用食指和拇指拿住玻璃板，前后左右振摇、摆动，并不时转动方 向，制成薄厚均匀、表面光洁平整、无气泡的薄层板，厚度为0.251.0mm。涂好后的硅胶G薄层板置于水平的玻璃板上，在室温下放置0.5h后（注意：室温放置必须
7、使玻板干透，否则会出现断裂现象），放入烘箱中缓慢升温至110C，恒温0.51h后取出，稍冷备用。2菠菜色素的提取称取20g洗净用滤纸吸干的的新鲜（或冷冻）的菠菜叶，用剪刀剪碎并与20mL甲醇拌匀，在研钵中研磨约5min然后用布氏漏斗抽滤菠菜汁，弃去滤液。将菠菜汁放回研钵，每次用 20mL 3:2 （体积比）的石油醚-甲醇混合液萃取两次，每次需加以研 磨充分并且抽滤。注意：因石油醚易挥发，抽滤时先倒少许清液浸润滤纸，抽滤时真空度不要太大！合并滤液，用吸管取上层深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用10mL水洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化。弃去水一甲醇层，石油醚层用无
8、水硫酸钠干燥30min后，滤入圆底烧瓶（勿将干燥剂滤入），在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为1mL为止。石油醚回收。3、点样取活化后的层析板，分别在距一端1cm处用铅笔轻轻划一横线作为起始线。另一端距约1cm处也划一横线作为终止线。取毛细管（直径0.5mm ）插入样品溶液中，在一块板的起点线上点两个点。样点间相距11.5cm。样点直径不应超过2mm。注意：点样时手指捏住毛细管下端，垂直点样，轻触薄层板后立即抬起。点样要轻，不可刺破薄层。因溶 液太稀或样点太小，可重复点样。但应在前次点样的溶剂挥发后，方可重点，以防样点被溶解掉。薄层色谱中样品的用量对物质的分离效果有很大在影响，所需样品的量与显色
9、剂的灵敏度、吸附剂的种类、薄层厚度均有关系。样品太少时，斑点不清楚，难以观察，但样品量太多时往往出现斑点 太大，造成拖尾，扩散等现象，影响分离效果。4、层析展开薄层色谱展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素。溶剂的极性越大，则对化合物的解吸能力越强，即Rf值也越大。如Rf值较大，可考虑换用一种极性较小的溶剂，或在原用展开剂中加入适量极性较小的溶剂。相反，如 原用展开剂使样品各组分的Rf值较小，则可加入适量极性较大的溶剂，如氯仿中加入适量的乙醇。常用展开剂的极性大小如下：水乙醇乙酸乙酯氯仿苯环己烷石油醚本次实验采用的以下展开剂：（a） 石油醚-丙酮=8:2 （体积比）点三块板（b）石油醚-乙酸乙酯=6:4 （体积比）点一块板薄层色谱的展开，须在密闭容器中进行（如图5-11 ）。在容器中加入一定体积的展开剂，内壁贴一张高5cm,绕周长约4/5的滤纸（目的是为了使展开剂蒸汽在烧杯内迅速达到平衡），下部浸入展开剂中，盖好表面皿。点样后的薄层板小心放入预先加入选定展开剂的烧瓶内，点样一端应浸入展开剂中0.5cm （注意不得超过点样线，否则样点将被溶解掉）。待展开剂上升至终止线时，取出层析板，在空气中晾干，用铅笔做出标记，并进行测量，记录溶质的最高 浓度中心至原点中心距离和展开剂前沿至原点中心距离，分别计算出Rf值。述城的折輦图展开方法图薄板及薄板点样方法
