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1、柑桔原生质体操作一、材料的准备1. 胚性悬浮系的建立：从固体培养基上取继代 20 天左右生长旺盛的愈伤 组织于 MT +ME 0.5g /L+ 谷氨酰胺 1.5 g/L +蔗糖 40g/L 的液体培养基中 （每 瓶 50 ml ）， 100 转振荡培养，每两周继代一次， 3 代后用于分离原生质体。2无菌苗的获得：柑桔种子无菌条件下播种于MT培养基上，20-30天后叶 片充分展开后用于分离原生质体。二、原年质体的分离1. 悬浮系原生质体的分离：用吸管吸取1g左右的继代6-10天的悬浮培 养物于15x60 mm的培养皿中，吸干培养基，加入1.5 ml 0.7 EME和1.5 ml酶 混合液，轻轻摇
2、匀，圭寸口膜圭寸口，置于摇床上（20-30转）或静置，28C暗条件 下酶解 16-24 小时。2. 叶肉原生质体的分离： 1.5 ml 0.6 EME 加入一 15x60 mm 的培养皿中， 在此培养皿用解剖刀将叶片切成 0.05-0.1cm 的细条，后加入 1.5ml 酶混合液， 轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28 C暗条件下酶解16-24 小时。三、原生质体的纯化：1. 酶解后的原年质体经孔径为45 “m的不锈刚网去掉渣质,CPW13洗涤 以收集大量原生质体, 滤液在 10ml 离心管中离心（100 转） 10 分钟，使原生质 体沉于管底。2. 沉淀物用 3ml
3、CPW25 悬浮，在其上轻轻加入 1ml CPW13 ， 100 转离心2-6 分钟，原生质体在两液面间形成一条带，其它杂质及少量原生质体沉于管底。 （注：如果此种情况下无法形成界面，则原生质体沉淀物用 CPW13 悬浮）3. 将原生质体轻轻吸出，置于另一离心管中，用电融合液离心洗涤 6-8 分钟，去掉上清液，用电融合液悬浮至5-10 x 105个/ml备用。（用血球计数 板调密度，一个大方格中原生质体数x10000即是原生质体密度）四、原生质体活性检查FDA用丙酮配制成5 mg/ml的浓度。按25 “1 FDA /ml原生质体的比例 加入 FDA， 5 分钟后在万能显微镜下检查原生质体活性（
4、暗视野下发荧光原生质 体数/明视野下原生质体总数）。注：叶肉原生质体发红色荧光，而悬浮原生质体发黄色荧光。五、原生质体融合一）PEG 法1. 将悬浮好的双亲原生质体等体积混合2. 用吸管滴2滴混合好的原生质体于15 x 60cm塑料培养皿中央，立 即加入 40% 的 PEG 2 滴诱导融合3. 10分钟后，加入稀释液（9A/1B） 2滴4. 15分钟后，从边缘缓缓加入12滴EME培养基，保持20分钟后用吸管沿边缘小心移走5. 从边缘再加入15滴EME培养基，保持10分钟后小心移走。6. 重复步骤 5 两次7. 最后加10-15滴BH3培养基，在培养皿中央形成一小池，沿培养皿 边缘加入15-20
5、滴BH3培养基，保持培养皿内的湿度，封口膜封口。二） 电融合法1. 将双亲原生质体用电融合液悬浮，混合备用（胚性愈伤组织原生质 体1-5 x 105个/ml； 叶肉原生质体10-20 x 105个/ml）.2. 融合小室先用融合液洗涤，以防原生质体聚集于电极两侧的角落里， 然后取大约0.8 ml （FTC-03 ）或1.6 ml （FTC-04 ）悬浮液于环形融 合小槽，融合小室中央加几滴电融合液以保持湿度， parafilm 封口。3. 静置5-10分钟，待大量原生质体沉淀后，在选择好的电融合参数下诱导融合，倒置显微镜下观察融合过程。4. 融合后，静置 15-20 分钟以利于融合的原生质体圆
6、球化。5. 轻轻吸出融合产物于 10ml 离心管中离心 5-6 分钟，用培养基悬浮 至 0.5-1 x 105 个 /ml .六、原生质体培养1. 原生质体培养常采用液体浅层培养或固体包埋培养法。2. 原生质体培养在暗培养箱中进行，3-10 天后原生质体再生细胞壁，并开 始第一产次分裂。3. 等原生质体分裂形成多细胞团时（大约 20-30 天），开始降低培养基的 渗透压，具体：1）各加入5-10滴0.6 M BH3和0.3M EME培养基，降 压至 0.45 M2）7 - 15天后再各加入5-10滴0.6 M BH3和0.3M EME培养基，降 压至 0.3 M3）此后要及时稀释，降低细胞团的
7、浓度，以利于胚状体发生，等细胞团长到一定大小时，转入 EME500 上诱导胚状体的发生。4）细胞团长出球形胚、心形胚后，及时转入EME 1500培养基上，以利于胚状体的进一步发育和转绿。5）将发育到子叶胚时期的胚状体转入生芽培养基 （MT+BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA 0.1mg/L）中诱导丛生芽。6）将丛生芽转入生根培养基（1/2MT+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L）中诱导生根或嫁接到试管中的砧木上。7）再生苗的鉴定及移植于温棚中。七、再生苗的鉴定方法1 形态学观察：叶形、气孔等。2 细胞学观察：海氏苏木精法3 分子标记鉴定： RA
8、PD， AFLP， SSR， CAPS， RFLP 等八、相关培养基的配方1. 酶液混合液（仅供参考，不同时间购买的酶活力不同，故浓度会有不同 程度的变化）40ml60ml甘露醇（12.7%）5.10g7.68gNaHPO.2HO (0.011%)0.0044g0.0066g242CaCl . 2H O (0.36%)220.144g0.216gMES (0.12%)0.048g0.072gCellulase R-10 (1.5%)0.6g0.9%离析酶 R-10 （3%）1.2g1.8g2. EME培养基：MT+500mg ME （麦芽提取物）0.3 EME:MT+500mg ME/L+ 1
9、02.5 g 蔗糖/L0.6 EME:MT+500mg ME/L+ 205.38 g 蔗糖/L0.7 EME:MT+500mg ME/L+ 239.61 g 蔗糖/LEME 500:MT+500mg ME/L+50g 蔗糖/L+7g 琼脂/LEME 1500: MT+1500mg ME/L+50g 蔗糖/L+7g 琼脂/L3. 电融合液 (100ml)甘露醇 (0.7M):12.74g无水 CaCl (0.25mM):0.02775g菌2PH值：5.8,高压灭4.CPWstockI(100ml)CPW stock II (100ml)KHPO0.272g24KNO31.0gMgSO 7HO2.
10、5g42KI0.002gCuSO 5HO420.00003g无水 CaCl1.5g2CPW13 (100ml)： CPW stock I 1ml + CPW stock II 1ml +13g 甘露醇CPW26 (100ml): CPW stock I 1ml + CPW stock II 1ml + 26g 蔗糖5 PEG 融合液( 100ml)HO280ml无水 CaCl20.97gGlucose5.41g定溶至 100ml，加热溶解，PH6.0，过滤灭菌62.25g稀释液 A ：Glucose7.21g稀释液 B: Glycine滤灭菌( 100ml)(KOH)无水 CaCl20.97g
11、PH 10.0 过DMSO10mlPH 6.0 过滤灭菌使用前按 9A:1B 混合澄清7 BH3 培养基（ 1升）MEl.Og蔗糖51.34g甘露醇81.99g谷氨酰胺3.1gMgSO 7HO0.37g42KH PO0.17g24KCl1.5gMT微量元素10mlMT Ca +MT vit +MT 铁盐各10ml水解酪蛋白0.25gVit Stock A2.0mlVit Stock B1.0mlKI Stock1.0ml有机糖贮存液10ml有机酸贮存液10m椰子汁20ml定容到1000 ml,pH5.8过滤火菌#KIst ock75 mg/ 100ml#有机酸贮存液(mg/100ml)丙酮酸钠盐柠檬酸 苹果酸 延胡索酸200400400400#有机糖贮存液(mg/100ml)果糖2500核糖2500木糖2500甘露醇2500鼠李糖2500纤维二糖2500半乳糖2500甘露醇2500#Vi t st ock A生物素 核黄素 叶酸 对氨基苹果酸 氯化胆碱 VCMg/100ml11020150100Caloium pantathenase50#Vit Stock BVit AMg/100ml1Vit D31Vit B122
