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1、紫红素-18的分离提纯陈真林（药学院2008级3班 学号：200807010331邮编：646000）指导教师：李东红（第三军医大学附属医院 一大坪医院 邮编400012）【摘要】目的：1确立以糊状叶绿素为原料制备紫红素-18的方 法，探究在酸解时不同PH值对紫红素-18产率的影响，为紫红 素-18的进一步化学修饰提供足够的原料。2探究不同展开剂对 紫红素-18的分离效果的差别。方法：用Hynninen选择性酸法水 解对糊状叶绿素进行粗提，调节粗提取溶液的PH值得到三组蚕 沙粗提物（脱镁叶绿酸a），再经过氧化反应得到紫红素-18粗品， 经硅胶柱层析分离纯化得到紫红素-18。结果:紫红素-18初
2、分产 品对蚕沙的收率为1.43%细分紫红素的纯度达到98%。结论：紫 红素-18的分离提纯的方法简单，操作性强，得到产物的纯度高, 对于它们进一步结构修饰有重要意义。关键字：蚕沙、脱镁叶绿酸、紫红素-18、分离提纯ABSTRACT : OBJECTIVE: To search for satisfactory preparation and purification conditions of purpurin 18 from silkworm excrement, and to offer enough reactants for the further modification of pu
3、rpurin 18. METHODS： At first, Pheophorbide a was extracted from the pasty Chlorophyll a by the method of Hynninen acid hydrolization, and the crude propheophoride a was gotten by stirring pheophorbide a in concentrated hydrochloric acid. And then the crude purpurin 18 was obtained by oxidation of ph
4、eophorbide a. The crude products were purified by silica gel column chromatography to offer pure propheophoride a and purpurin 18. RESULTS： The yield of pururin 18 is 1.43% and its purity was 98%. CONCLUSION： It is a successful method by which pururin 18 from silkworm excrement is purified.The metho
5、d is simple,flexible and operable. Further modification of Pyropheophorbide as structure seems to be of importance as well.KEY WORD：肿瘤光动力疗法(photodynamictherapy,PDT)是利用光敏剂和光的光动力学 反应治疗肿瘤的一种无创或微创疗法。PDT作为一种冷化学反应，作用效果与 所用光敏剂类型、照射条件、组织氧代谢状态，细胞类型有关。其治疗基础为先 给予对肿瘤组织有选择性摄入作用的光敏剂，然后用一定波长的光辐照瘤区，诱 发光敏剂产生光动力反应，导致
6、肿瘤组织坏死而达到治疗目的。PDT因能相对 选择性地杀伤肿瘤细胞，对健康组织损伤小，并发症及毒副作用少从而成为一项 非常有效治疗肿瘤的的方法。迄今，肿瘤光动力疗法(PDT)现在已经发展成为 肿瘤的法定疗法之一。光敏剂的性质直接决定了肿瘤光动力疗法的治疗效果。现在国内外临床应用 的光敏剂如血卟啉衍生物(HPD)、癌光啉(PSD-007)等均为复杂的多组分卟 啉混合物【1】，且作用光谱不理想【2】。且在吸收波长为600800um的治疗窗内 吸收系数小而影响到组织的有效光动力反应深度，此外，他们的化学组成不定， 有效成分尚未完全阐明而影响其深入的光生物学机理研究和难以发展成为单体 法定新药，因此我们
7、不断尝试研究新型的光敏剂。叶绿素降解产物（如脱镁叶绿酸【3】及紫红素-18【4】）及其衍生物，由于其较 高的肿瘤选择性摄入及较强的光敏化氧化特性，（根据文献报道：叶绿素降解产 物及其衍生物在红光区的吸收系数较现在广泛应用于肿瘤光动力疗法的混合卟 啉制剂约高一个数量级），从而极大地增高了光动力损伤深度，成为光动力治疗 癌症新药发展中颇受关注的研究对象，现在已经被用于肿瘤的荧光定位和光敏治 疗【5】。蚕沙（家蚕粪）是蚕业的主要副产物之一，其中，叶绿素含量占蚕粪干物的 1%左右，是一种丰富廉价的叶绿素资源，而蚕沙中占叶绿素总量75%以上是叶 绿素a。本实验以家蚕粪叶绿素粗提物（蚕沙粗品叶绿素）为原料
8、，经酸降解反 应得到叶绿素a的降解产物脱镁叶绿酸a，对脱镁叶绿酸a进一步氧化碱降解得 到紫红素-18粗品。脱镁叶绿酸a紫红素-181材料与仪器1.1实验仪器高压液相色谱仪（美国，Agilent 1200 Series）、DU800型紫外可见分光光度计 （美国Beckman公司），Varian 640-IR红外光谱仪（美国），YP-2压片机（上海山岳科学仪器有限公司），CCA-20低温冷却水循环泵（巩义市予华仪器有限责任公司），旋转蒸发仪RE-5299（巩义市予华仪器有限责任公司），循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），521-I恒温磁力搅拌器（上海司乐 仪器有限公司），DZF-6050
9、型真空干燥箱、电子天平、玻璃柱子、电子秤、氧 气袋、1.2实验试剂氯仿、乙醚、浓盐酸、THF、正丙醇、甲醇、丙酮、甲酸、三氟乙酸、乙氰等 均为分析纯，氢氧化钠浓溶液（10 mol/1），氢氧化钾（固体），稀盐酸，氧气， 蒸馏水。1.3实验材料蚕沙（海宁凤鸣叶绿素有限公司检验批号20100209）硅胶（安徽良臣硅源材料有限公司 批号110423）2 实验方法2.1紫红素-18的分离提纯2.1.1脱镁叶绿酸a粗品的提取 称取糊状叶绿素100 g于2000 ml烧杯中，加入 乙醚500 ml在冰浴下搅拌至完全溶解。再加入浓盐酸500 ml，在冰浴中搅拌约 10 min,转入分液漏斗，加入冰水300
10、ml,摇匀，静置25 min,由于分层不明显 根据加入水和酸的总量接取下层溶液，用10 mol/l的氢氧化钠溶液调PH至5、6、 7三组值，分别编号为A、B、C三组。有黑色沉淀出现，抽滤，减压干燥，分 别收集。2.1.2紫红素-18粗提物提取 称取蚕沙提取物（脱镁叶绿酸a）粗品1.50 g于250 ml三颈瓶中，加入120 ml乙醚和40 ml的四氢咲喃（THF），搅拌5 min，使其 完全溶解，通入氧气，加入含有2.50 g KOH的正丙醇40 ml,搅拌反应2 h后停止， 将混合液移入分液漏斗中，加入去离子水200 ml，摇匀，静置，待分层明显后接 取下层溶液。用稀盐酸调PH至34左右有黑
11、色颗粒出现，抽滤，减压干燥， 收集备用。2.1.3紫红素-18的分离纯化取200300目硅胶约300 ml，流动相为 氯仿：丙 酮：甲醇=400:30:40，称取紫红素粗品0.25 g用流动相溶解，过滤，滤液湿法 上样，用以上流动相进行柱层析，分为三带，第一带为淡黄色，第二带为紫红色（稍带黑色），第三带为绿色。收集第二浓紫红色带，旋转蒸干得纯紫红素-18 初分品，减压干燥，固体备用。2.2 HPLC定性分析及纯度检测色谱条件 Zorbax 300 Extend-C18色谱柱（250 x 4.6 mm,含保护柱）；洗针上样 量30 ul, 410 nm检测，0.5 s,柱温为25C，流动相（D）
12、：含5%乙腈，0.1% THF的水,C： 含0.1% THF的乙氰，0-100% 15 min梯度洗脱，流速为1 mL.min-1,进样量为30l。3实验结果3. 1数据表如下:蚕沙蚕沙提取粗品紫红素粗品紫红素初分（百分含量）PH=5 (A)700 g16.72 g7.12 g2.38 g(88.8%)PH=6 (B)700 g18.48 g9.75 g3.08 g(55.2%)PH=7 (C)700 g22.37 g13.18 g4.32 g(73.4%)3.2 HPLC检测结果紫红素-18粗品经一次硅胶柱分离后，HPLC检测得到了较纯的紫红素-18，其与对照品的谱图如下：VWD1 A,波K
13、=410 nm (DJLDJL 2011-08-23 16-24-20001-0101 .D) mAU2000-1500-1000-500-i10i1520ii25min紫红素-18对照品（纯度86%）A (PH=5)紫红素-18 (纯度 88.8%)Enls队L刃巴.V- W樂八 oerDt WEN二uuuuu|uuuuuuu|uuuuIIuuyuu|uuD1557.5101Z51517.520minB (PH=6) 紫红素-18 (纯度 55.2%)WD1 A. - ： =410 IW (GLPGtF 20124-15D)rftftU1-4001300HMD000更鲁X suuiIJ Z石
14、2八40D2000i i i i i i i i | i i i | i | i i | i i | i | i i |557与1d心IE1T.EminC (PH=7)紫红素-18 (纯度 73.4%)3.3紫红素-18细分HPLC检测本组实验采用PH=7 (C)的粗品进行细分(因为其绝对产率最大)。探究了三组不同的流动相，第一组流动相为：氯仿：丙酮：甲醇=10:1:0.3第二组流动相为：氯仿：丙酮：甲醇=10:1:0.5 第三组流动相为：氯仿：丙酮：甲醇=10:1:0.7紫红素-18粗分品紫红素-18细分品（纯度）第一组200 mg73.7 mg (98%)第二组200 mg73.8 mg (97.5%)第三组200 mg71.3 mg (93-95%)三组不同展开剂所得的高效液相色谱图如下:4W-0-01 A. 5L-.=dl0rmlGLH2012-Ofl-K 11-訥胡02程OfnU -00-00-203-5 I I Ii i i i |101251517.52D minI7.5第一组（纯度大于98%）VWD1 A, K =410nm (GIF2D12-04- 1!l 11-14fiD5-D5D1 D mAU帖Od140
