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1、dsRNA 和 RNA 干扰技术综述 * 审校 彭*(中南大学湘雅医学院)摘要：dsRNA在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象称为RNA干扰。其机理的 日渐阐明使它有可能在基因敲除，基因功能测定等方面成为一项成熟的技术，这将在生命 科学领域中引起深刻变化。本文就dsRNA和RNA干扰的关系，RNA干扰的机制和特点，RNA 干扰技术的应用前景等作一综述。关键词：dsRNA; RNA干扰；RNA干扰技术；基因沉寂外源和内源性双链 RNA(double-stranded RNA dsRNA) 在细胞内诱导同源序列的 基因表达受抑的现象称为RNA干扰。早在十年前，科学家们在向牵牛花转导色素合成基因
2、 时，观察到“共抑制”(cosupression),不仅是转入的基因为表达，而且自身的色素合成 也减弱了。相似的现象还发生在真菌的研究中，当把合成类胡萝卜素的基因转入到红色面 包霉中时，却导致了大约 30转染细胞自身基因的失活，这种现象称为“缓解” (quelling)。但是这种现象一直得不到令人信服的解释。1998年，在研究秀丽隐杆线虫 基因沉默机制时发现，将反义RNA、正义RNA和双链RNA分别导入虫体内，作为对照组的 正义核酸，虽不能与活性基因或mRNA结合，却同反义核酸有相似的阻断基因表达能力， 与反义RNA传统机制相违背、而另人惊奇的是，双链RNA较正义RNA和反义RNA能更高效 地
3、阻断相应基因的表达，一直基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级。Fire等称 这种现象为 RNA 干扰现象。 RNA 干扰现象已证实在一系列的生物中存在，包括植物1、 真菌2、锥虫3、囊虫4、果蝇5和线虫 6。新近科学家在哺乳动物细胞中也观察 到了这一现象7。生物界普遍存在的 RNA 干扰现象给现代生命科学所带来的冲击将是无 法估量的，它将不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可 能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。一、dsRNA的形成由于 dsRNA 抑制基因表达具有潜在高效性，正常机体任何导致 dsRNA 形成的情况都 会引起不需要的相应基因沉寂。所
4、以正常机体内各种基因有效表达显然需要一套严密防止 dsRNA形成的机制。这些机制包括：在进化水平上淘汰那些在两条DNA链上相应位置上都 有启动子的基因，否则两条DNA链同时转录出两条互补的RNA就可能形成dsRNA；在正常 生理条件下 dsRNA 的形成必须具有一定的条件如两条互补 RNA 链相遇，互相识别和一定浓 度的 RNA 连接蛋白存在；在偶然情况下形成的 dsRNA 还必须具有抵御解链，共价修饰和降 解双链 RNA 等酶作用的能力。此外，细胞对于外来的 RNA 和自身转录过程中生成的变异 RNA（aberrant RNA）所产生的dsRNA引发RNA干扰能力大于拥有自身mRNA序列的d
5、sRNA。 与这些设想一致的实验在线虫和锥虫中得到证实8。引发 RNA 干扰的 dsRNA 产生机制是通过对 RNA 干扰现象深入研究推断而来的。它包 括内源性和外源性两个方面： RNA 干扰作为一种防御外来核酸的免疫机制，外来核酸（包 括DNA和RNA）的侵入就可能导致dsRNA的产生，如RNA病毒的入侵，DNA病毒在胞内的 转录，基因工程中导入转基因，插入逆转的 DNA 片段等；内源性的 dsRNA 产生主要是通过 RNA依赖的RNA合成酶（RDRP）的作用，它催化合成与机体转录过程中形成的异常RNA互 补 RNA 链而形成 dsRNA9。细胞外dsKNA成示意图= 启动子 二、dsRNA
6、介导RNA干扰的机制1998 年 Andrew Fire 将 dsRNA 导入线虫内观察到 RNA 干扰现象后6，科学家又在 一系列的低等生物中观察到同样的现象，然而将dsRNA （长度30bp）导入常用哺乳动物 细胞培养株时却不能观察到特异的RNA干扰现象，而是出现诱生干扰素，活化核糖核酸酶 L,细胞的基因表达全面受抑和细胞凋亡的现象5, 9。这不禁使人疑问，哺乳动物中能 不能被dsRNA诱导出RNA干扰。但是，实验证明，小鼠的卵母细胞和早期的胚胎中却存在 这一现象10。随后，Zamore的研究小组发现诱发RNA干扰时dsRNA被切成21-25个碱 基的RNA片段11，同样，这些小片段的RN
7、A也在果绳细胞外RNA干扰模型中出现12。 科学家把这种小片段的RNA称为小干扰RNA （small interfering RNA siRNA），并且猜测 RNA干扰正是由siRNA诱导。Elbashir SM工作组将体外合成的21nt的siRNA导入哺乳动 物细胞培养株中也检测到了特异的RNA干扰现象7。如图所示：内源性dsRNA在细胞内ATP和Dicer酶作用下切割为小片段干扰 的干扰RNA，siRNA和另外几种蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物（RISC）。 RISC结合与siRNA互补的同源基因的mRNA后，mRNA被复合物中具有RNA酶 作用蛋白酶降解。从而导致该基因的表达沉默。外
8、源性的siRNA，和细胞内产生 的发夹RNA都是在细胞质中形成RNA的沉默复合物发挥作用。尽管 RNA 干扰的具体的机制和过程还不十分的清楚，研究资料显示 RNA 干扰过程可概括如下：第一步是dsRNA的处理；dsRNA经过一种核酸酶III类似的RNA内切酶Dicer作 用，把dsRNA链酶切成长约21到25nt的dsRNA链，每条链都有2个碱基的突出。对线虫 和哺乳动物Dicer分析表明，该酶包含三个区域：螺旋酶区，dsRNA结合区，PAZ区13。 第二步是siRNA介导的同源mRNA降解：siRNA和另一些尚未完全确认的蛋白结合形成复 合物RNA 诱导沉默复合物(RNA-inducing
9、silence complex, RISC)。RISC 再识别，结合与 siRNA 中的反义链互补的 mRNA。 RISC 具有核酸酶的功能，在结合部位切割 mRNA14，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端11。被切割后的断裂mRNA 随即降解，从而使该基因的表达受抑，这就是转录后的基因沉默( post-transcription gene silencing PTGS)。 RISC 的大多数蛋白质成分没有得到确认，推测它们可能包括核 酸内切酶，核酸外切酶，螺旋酶和同源搜寻活性结构域14。值得注意的是dsRNA (30bp)不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞 全面的基因
10、表达受抑和凋亡。研究显示dsRNA (30bp)导入哺乳动物细胞可诱导干扰素 的合成。在这一过程中，dsRNA结合并激活蛋白激酶K (PKR) 15和2, 5 -寡腺苷酸合 成酶(2，5, -AS) 16。活化的PKR磷酸化翻译启始因子eIF2a使其活性降低从而抑制 基因表达；经激活的 2 5 -AS 合成 2 5 -寡腺苷酸则可活化一种核糖核酸酶 L 降解 mRNA。结果是非特异性的和全面的抑制基因表达，最终导致细胞凋亡。三、RNA干扰的特点RNA 干扰以被美国科学杂志评为 2001 年十大科技突破之一，有关研究文献相继在权威 杂志发表，科学家对RNA干扰现象之所以表现出极大关注和兴趣，就在
11、于RNA干扰在基因 功能和相关方面的研究中具有许多传统方法无法比拟的特点和优势。1. 特异性RNA干扰的最显著特征就是只引起与dsRNA同源的mRNA降解。实验表明, dsRNA能在果蝇细胞中特异性的抑制外来的短暂表达，稳定表达的转基因和细胞内自身固 有的内源基因表达，而对其它无关基因的表达不受影响。2. 高效性 无论是在体内还是体外实验中，仅需少量的 dsRNA (每个细胞几个分 子)就能有效的抑制靶基因表达，抑制的效率在低等动物中90%。这表明dsRNA介导的 RNA干扰是一个以催化放大的方式进行的6。3. dsRNA长度限制性 引发有效RNA干扰的dsRNA最短不得短于21碱基，而且长
12、链ds RNA也在细胞内被Dicer酶切割为21nt左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切 割。4 可传播性 RNA 干扰有一种令人惊奇的跨越细胞界限的能力，在果蝇细胞中可 在细胞群落之间传播5。在线虫中可在局部注射 dsRNA 而传播到整个机体6。研究人 员给实验鼠尾部的血管注入旨在“沉默” FAs基因的小干扰RNA,发现有90%的肝细胞接 收到了这种 RNA 分子。5. ATP依赖性 在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个 ATP依赖的过程11。可能是Dicer和RISC的酶切反应是必须由ATP提供能量。四、RNA干扰技术的意义依据RNA干扰现象，科学家
13、建立了 RNA干扰技术，即人为设计合成针对某特定基因 序列的dsRNA来关闭或抑制该基因的表达。尽管RNA干扰尚存在一些问题，要成为一项 成熟的技术还有待时日。但RNA干扰已被多次证实是一种特异、高效、经济的使基因表 达受抑的技术手段。它可有效地将靶基因的表达水平降到一个低的水平，甚至于完全的 清除。美国麻省理工大学医学中心Phillip Zamore预言“RNA干扰将在哺乳动物细胞 遗传学上引起革命性的变化。”人们不再需要花 6 个月的时间设法去关闭某个基因的表 达，利用这项技术，可以在一周之内就可关闭 10个基因。一旦 RNA 干扰技术得到完善，它给生命科学领域的冲击是无法估量的。它有可能
14、 在以下几方面发挥重要的作用。基因功能的研究：与使用基因敲除技术来检测基因 功能相比，RNA技术却能方便，快捷的达到这一目的，即使是在一般条件的实验室也可 开展这项工作。科学家已经利用它检测了线虫两个染色体上几乎所有的基因功能17， 18。RNA干扰技术可在功能基因组的研究中发挥重要作用。抗病毒作用我们可将 病毒在复制中起关键作用的基因作为目标设计dsRNA来抑制病毒的复制。自1986年植 物学家首次利用转入烟草花叶病毒（TMV）的核衣壳（CP）基因导入植株培育出抗病毒 植株后，已培育了一大批抗病毒植株19。最近，斯坦福大学在小鼠内进行 RNA 干扰 实验成功的防止细胞受丙型肝炎病毒感染 20
15、 。麻省理工学院用 RNA 干扰技术封锁 了艾滋病病毒的基因21。基因治疗RNA干扰技术开辟了基因治疗的新思路。我们 可以用抑制疾病基因表达的办法来达到治疗目的，臂如导入针对致癌基因的 dsRNA 来 防治癌症。哈佛医学院在实验小鼠中设计针对凋亡相关蛋白质（Fas）基因的干扰RNA 成功的治疗了小鼠的肝炎22。五、RNA干扰中存在的问题如前所述 RNA 干扰现象的发现和 RNA 干扰技术的建立给生命科学领域带来巨大 的冲击和光明的前景。但已有的实验也表明，RNA干扰尚存在一些问题待解决如：可能 存在一些基因或组织具有抵抗 RNA 干扰的能力，线虫的神经系统即具有这种能力8； dsRNA 序列选
16、择不同可能导致不同的抑制效果，并且只能在外显子序列中选择7；在 哺乳动物中诱导 RNA 干扰必须是 21nt 左右的 siRNA ，而且其抑制效果不如在低等生物 中。 RNA 干扰对稳定，丰富表达的靶基因抑制效率不高23；此外， RNA 干扰和反义 RNA 技术一些相似的缺点，如寡聚核酸合成困难，易被降解，细胞摄取效率低等。这些问题的最终解决尚有待于 RNA 干扰机制的彻底阐明。目前科学家采取的策略是 针对靶基因外显子不同序列体外合成多对21nt的siRNA，并在其3端设计两个胸腺嘧 啶 T 突出以防止 RNA 酶的降解，观察并确认抑制效果最大的序列。参考文献1. Waterhouse PM, Graham MV, Wang MB. .Virus resistance
