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1、细胞培养完整手册常用设备 准备室的设备:单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品)、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平(称量药品)、 计(测量培养用液 PH 值）、磁力搅拌器(配置溶液室搅拌溶液）。培养室的设备：液氮罐、储品柜(存放杂物)、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（ 80)、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机(收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、 CO2 孵箱(孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、 冰箱（放置erum 和培养用液)。无菌操作基本技术 无菌室的灭菌:定期打扫无
2、菌室：每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用 3 来苏尔或者新洁尔灭或者. %过氧乙酸擦拭。.CO2 孵箱(培养箱)灭菌:先用 新洁尔灭擦拭，然后用 75 酒精擦拭或者 0 %过氧乙酸，再用紫外灯照射。3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 030 分钟。4.实验后灭菌:用 75 %酒精（ 3 新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 5.定期检测下列项目:钢瓶之CO2 压力；CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换）；无菌操作台内之irfow压力，定期更换紫外线灯管及HEA 过滤膜,预滤网(0 小时/预滤网，0
3、0 小时/HEP)。.水槽可添加消毒剂(ephin 1:70)，定期更换水槽的水。实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用%酒精棉球擦净双手。 无菌操作的演示:1.凡是带入超净工作台内的酒精、 B 、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 5 酒精擦拭瓶子的外表面 2靠近酒精灯火焰操作。 3器皿使用前必须过火灭菌 4.继续使用的器皿(如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。 6吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。器械的清洗和消毒玻璃器械洗消:一、新的玻璃器皿的洗消：1.自
4、来水刷洗,除去灰尘。2烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5 稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 泡酸、清洗：用清洁液(重铬酸钾10g :浓硫酸 200m ：蒸馏水 10ml )浸泡12小时,然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15 次,最后蒸馏水冲洗 3-5次和用双蒸水过 3 次。 5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸(油光纸)包装。6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子,打开开关和安全阀,当蒸气成直线上升时,关闭安全阀,当指针指向 5 磅 时，维持 20-3 分钟。 7高压消毒后烘干
5、 二、旧的玻璃器皿的洗消: 1.刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液), 小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗 3 次。 .烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸)等包装,以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。 4.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内,盖好盖子，打开开关和安全阀,随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出 -5分钟后,关闭安全阀,气压表指数随之上升，当指针指向5磅 时,调节电开关维持
6、20- 分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上) 5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿,所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消:金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75 酒精擦拭，再用自来水,然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内1 磅 高压( 30 分钟）消毒,再烘干备用。 橡胶和塑料: 橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1.针式滤器帽不能泡酸液 , 用 NaO泡-12小时 ,或者煮沸 2 分钟, 在包装之前要装好滤膜两张，安装滤
7、膜时注意光面朝上 （凹向上 ) ,然后将螺旋稍微拧松一些,放入铝盒中在高压锅内 1 磅 30 分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。 2胶塞烘干后用 2 氢氧化钠溶液煮沸 分钟（用过的胶塞只要用沸水处理3 分钟)，自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液0 分钟，再用自来水，蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。 .胶帽，离心管帽烘干后只能在 氢氧化钠溶液中浸泡612 小时(切记时间不能过长)，自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液 30分钟，再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。.胶头可用 75 酒精浸泡 5 分钟，然
8、后紫外照射后使用即可。 5.塑料培养瓶，培养板，冻存管.6.其他消毒方法:有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒,可用 70 酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上,直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23 周时间洗除残留的氧化乙烯。用 20000100000rd的 射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后,用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹,一经高温,即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制:氯化钻 (Co122o) 2g，0盐酸 10m1,蒸
9、馏水8m1。注意事项: 严格执行高压锅的操作规程:高压消毒时,先检查锅内是否有蒸馏水,以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅,以防高压时爆炸。2安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上,否则起不到过滤的作用。3注意人体的防护和器皿的完全浸泡: A. 泡酸时要戴耐酸手套,防止酸液溅起伤害人体。. 从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面,会腐蚀地面。 器皿浸入酸液中要完全,不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。细胞培养用液的配制与消毒器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素 . 纯净水系统、电子天平、 H 计、磁力搅拌器。具体步骤:一
10、、水的制备： 细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。二、B 的制备与消毒( 也可用于其它BSS ，如: Hanks ， D-ank液的配制 ):.溶解定容：将药品（ aCl8.0g ，Cl 0 ， P4HO 15 ， H2PO4. g )倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动,充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 10ml ,摇匀即成新配制的 PBS 溶液。 2.移入溶液瓶内待消毒：将 PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内 8磅 消毒 2 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 三、胰蛋白酶溶液的配制
11、与消毒: 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0 、温度为7 时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+ 、 M2+ 和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+、 Mg2+ 的 BSS ,如： D-as 液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调
12、P 到7.2左右）或 ( D-hank ）液中。搅拌混匀,置于 4 内过夜。 2用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(022 微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于 -2保存以备使用。四、抗生素溶液的配制1所用纯净水(双蒸水）需要 5 磅 高压 20分钟灭菌。 2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位 瓶，用注射器加 ml灭菌双蒸水。链霉素是0 万单位 瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为2 万单位。 3.使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为 10单位 /m 。 1单位= 1 微克?4.细胞库之细胞培养基不加抗生素 5.培养自AT引进之细胞株,培养基中不
13、加抗生素。6.培养自其它实验室引进之细胞株，制作oken freeze 前培养基须添加抗生素，待tkenfreez通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。7寄送活细胞时，须将培养液充满整个 sk时，则须添加抗生素 。 (enicilln 100 uitml+sretomyn 1 ug/） .若要检测mycplas，则培养基内不可添加gntamcn，因gemcin 会抑制 myplasma 生长。9.去除细菌污染之抗生素混合配方:pnicil 250 units/ml,stretomyin 50ug/, ncin 250 u/ml， bacitracin25 units/ml 注意混合使用后药物
14、毒性会增强。0.抗生素使用种类与浓度: 工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌 enicilli uim -20 (） bacteria stetomyci 00 ug/ml -20(+) and G（) ateria chlotealine 50 ul -2 (+） ndG(） bacteragentaicin 0g/m -20 G(+) anG(-) bacteria,clas mphoterici B 2.5 uml -0 yeast anls ysatn ug/l 20 yeast andold fugizone 2.5/ml 20 ast nd ods五、RPM140 的制备与消毒:1.溶解、调 H 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中, 并用双蒸水冲洗包装袋 23 次 ( 冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解 ， 并按照包装说明添加一定的药品. 然后
