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1、PCR法扩增大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因及PCR产物的纯化i. 实验原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称 PCR, 1983 年由 Dr. Kary B. Mullis 发明，是一种选择性的体外扩增DNA或RNA的分子生物学技术。PCR技术的基本原理类 似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA的变性(denature):模板 DNA经加热至94C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作
2、准备；模板 DNA与引物 的退火(anneal ):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至 50C左右，引物与模 板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸(extension) ： DNA模板一引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配 对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环：变性一退火一延伸这三个过程就可获得更多的 半保留复制链”，而且这种新链又可 成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩增目的基 因扩增放大几百万倍。图1 PCR反应示意图本实验以提取的大肠杆菌E. coli JM
3、109基因组DNA作为反应模板，利用合成的引物对 编码甘露醇-1-磷酸脱氢酶的DNA序列进行PCR反应扩增，以获得甘露醇-1-磷酸脱氢酶目 的基因。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并用DNA纯化试剂盒进行纯化回收。2. 实验用品(1)材料实验一所制备的大肠杆菌E. coli JM109基因组DNA溶液试剂1) 天根生化科技有限公司的PCR反应试剂盒，含ddH2O、2x PCR反应混合液(包括 dNTP、Tag酶、PCR缓冲液等)；2) 上游引物、下游引物(设计后由公司合成)；3) 石蜡油；4) 琼脂糖；5) 10xTBE 电泳缓冲液:称取 Tris54g,硼酸 27.5g,并加入 0.5mo
4、l/LEDTA(pH8.0) 20mL,定容至1000mL；6) 6x上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40% (w/v)蔗糖水溶液；7) EB溶液母液：将EB配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹；8) 生工生物工程(上海)有限公司的BS363-N柱式PCR产物纯化试剂盒。包括吸附 缓冲液(Bin di ng Buffer)、漂洗液(Washi ng Buffer)、洗脱液(Elution Buffer)。(3)仪器超净工作台、高压灭菌锅、高速离心机、移液枪、PCR扩增仪、水平电泳仪、电泳 仪电源、凝胶成像系统、电炉。3. 实验步骤(1)引物设计在 ncbi (http:/www.ncbi.nl
5、m.nih.gov/)上查询 Escherichia ccrhannitol-1-phosphate dehydrogenase(MTLD)的基因序列，作为模板设计引物。检索得到，该蛋白质由382个氨基酸组成，具体序列如下：1 mkalhfgag n igrgfigkll adagiqltfa dvnq vvldal n arhsyqvhv vgeteqvdtv61 sgvdavssig ddvvdliaqv dlvttavgpv vleriapaia kglvkrkeqg n esp ln iiac121 en mvrgttql kghvm nalpe dakawveehv gfvdsavd
6、ri vppsasat nd plevtve tfs181 ewivdktqfk galp nipgme ltd nlmafve rklftl ntgh aitaylgkla ghqtirdail241 dekiravvkg ameesgavli krygfdadkh aayiqkilgr fen pylkddv ervgrqplrk301 lsagdrlikp llgtleyslp hkn liqgiag amhfrseddp qaqelaalia dkgpqaalaq361 isdlda nsev vseavtayka mq其全基因序列如下，长度为1149个bp：1 atgaaagcat
7、tacattttgg cgcaggtaat atcggtcgtg gctttatcgg taaactgctg61 gcagacgcgg gtatccaact gacgtttgcc gatgtcaatc aggtggtact tgatgccctg121 aatgcccgtc atagctatca ggttcatgtg gtcggtgaaa ccgagcaggt agataccgtt181 tccggcgtcg atgctgtcag cagcattggt gatgatgtcg ttgatctgat tgctcaggtc241 gatttagtca ctaccgccgt tggcccggtt gtg
8、ctggaac gtattgctcc ggctatcgcc301 aaagggctgg tgaaacgtaa agaacaaggt aatgaatccc cgctgaacat catcgcctgt361 gaaaacatgg tacgcggtac cacgcagctg aaaggtcatg tgatgaacgc cctaccagaa421 gacgccaaag cgtgggtaga agaacacgtt ggctttgtcg attccgccgt tgaccgcatc481 gtaccgcctt cggcttcggc aactaacgat ccgctggaag tgacggtaga aactt
9、tcagc541 gaatggattg tcgataaaac gcagttcaaa ggcgcactgc cgaacatccc aggcatggag601 ttaaccgaca acctgatggc atttgtcgaa cgtaaactct tcaccctgaa cacgggtcat661 gctataaccg cgtacctcgg aaaactggcc ggtcatcaga ccattcgtga cgctattctc721 gacgagaaaa tccgcgcggt ggtaaaaggt gcgatggaag aaagtggtgc ggtactgatc781 aagcgctacg gctt
10、tgacgc agacaaacat gcggcgtaca tccagaaaat cctcggtcgt841 tttgagaacc cgtatctgaa agatgatgta gagcgcgtag gccgtcagcc gctgcgtaaa901 ctgagtgctg gcgaccgtct gatcaagcca ttgctcggta cgctggaata cagccttccg961 cacaagaatc tgattcaggg gattgctggt gcaatgcact tccgcagtga agacgatccg1021 caggctcagg aactggcagc actgatcgct gacaa
11、aggtc cgcaggcggc gctggcacag1081 atttccgatc ttgatgccaa cagcgaggtt gtatccgagg cggtaaccgc ttataaagca1141 atgcaataa /根据以上DNA序列和所采用的表达质粒载体pET-28a-c(+)的图谱，用Primer Premier 5.0软件设计了两对引物。在上游引物和下游引物上分别设置BamHI和SacI的酶切位点， 这两个不同的限制性内切酶识别位点分别在引物中以下划线的方式标记出来。引物序列如 下：上游引物 5-GTTGGATCCATGAAAGCATTACATTTTCGCG-3(BamHI)下
12、游引物 5-TGGGAGCTCATTATTGCATTGCTTTATAAGCG-3(SacI)(2)基因扩增以提取的基因组DNA作为反应模板，利用合成的引物对编码MTLD的DNA序列进行 PCR反应扩增。在PCR管中分别依次加入以下试剂：试剂体积/ddH2072x PCR反应混合液10上游引物1下游引物1模板E.coliJM109全基因组1总体积20手指轻弹管壁混匀后，加20石蜡油覆盖于混合物上，防止PCR过程样品中水分的蒸发。反应参数：94C5min55C 1mi n55C1min94C1min72C2mi n72C10min当所有的反应都完成以后，设置PCR仪的温度保持在4C。反应完毕后各取
13、5pL用1%琼脂糖凝胶电泳检测，基因长度约为1150bp。DNA Marker 取5pL直接进行加样。电泳完毕，在紫外灯下观察结果并拍照。(3)PCR产物的纯化采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，具体步骤如下：1) 取剩余酶PCR产物至1.5ml离心管中。2) 加 5 倍体积的 Binding buffer。3) 把混合液吸至装有吸附柱的2mL离心管中，室温下静置2分钟。4) 8000rpm离心1分钟，弃2mL离心管中离心液。5) 在吸附柱中加500pL Washing buffer， 10000xg(rcf)离心1分钟，弃离心液6) 再加 500pL Washing buffer,10000x
14、g(rcf)离心 1 分钟，弃离心液。7) 10000xg(rcf)再离心1分钟，以甩去多余的液体。8) 在柱中间薄膜中滴加15pL Elution buffer， 50U保温5分钟。9) 把吸附柱转移至新的1.5mL离心管中，10000xg(rcf)离心1分钟，弃吸附柱，1.5mL离心管中离心液即为纯化后的PCR产物。4. 注意事项1. PCR反应的灵敏度很高，为了防止污染，使用的0.2mL的Eppendorf管和吸头都必 须是新的、无污染的，实验操作需戴上一次性手套，操作应尽可能在无菌操作台上进行。2. 使用工具酶和DNA样品的操作必须在冰浴条件下进行，使用后有剩余的应立即放 回冰箱中。3应设含除模板DNA所有其他成分的阴性对照。4. 引物的使用浓度一般为0.1-1.0pmol/L，浓度过高易形成引物二聚体或增加非特异 性产物；过低则影响效率。5. PCR产物要经电泳鉴定，得到分子大小一致的目的条带后再进行PCR产物的纯化和回收, 在用凝胶电泳检查时，样品可存放于4C。
