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1、乳腺癌中p73和p53表达与化疗药物敏感性的关系【关键词】乳腺肿瘤Relatinshipbeteenexpressinfp73andp53andhesensitivityinbreastaner【Abstrat】AI:Tinvestigatetherelatinshipbeteentheexpressinfp73andp53inbreastanerellsandhesensitivity.ETHDS:Telvesurgialsaplesfpathlgiallydiagnsedbreastanerereused.Theanerellsereislatedandulturedintheinubat
2、rat37,50L/L2invitr.Theinhibitryratesfanerellsby4kindsfantianerdrugs(EPI,5FUandDDP)ereassayedbyTTethd.Iunytheistryasusedtdetettheexpressinfp73andp53intheanerells.RESULTS:Thesensitivityfthe12breastanerellsin0.1PPithin72hinvitras42%(),33%(EPI)and17%(bth5FUandDDP).Theinhibitryratesf,EPI,5FUandDDPeresign
3、ifiantlyhigherinp73psitiveanerellsthaninp73negativeanerells.Apsitiverrelatinasfundbeteentheexpressinfp73andhesensitivityinallthefurantianerdrugs.NLUSIN:Theexpressinfp73isrelatedtthehesensitivityfthebreastanerellsanditanbeusedasnefthearkersfrlinialassessentftheeffetfhetherapy.【Keyrds】breastneplass;ge
4、nes,p73;genes,p53;hesensitivity【摘要】目的：研究乳腺癌细胞p73、p53表达与化疗药物敏感性的关系.方法：选取病理诊断为乳腺癌（术前未行放疗、化疗）的手术切除标本12例，体外分离细胞作培养，应用四甲基偶氮唑盐（TT）法分析表阿霉素（EPI）、丝裂霉素（）、5氟脲嘧啶（5FU）、顺铂（DDP）4种化疗药物对乳腺癌细胞的相对抑制率，通过免疫细胞化学染色法分析乳腺癌细胞p73、p53的表达.结果：0.1PP浓度时乳腺癌细胞对4种化疗药物的敏感率分别为（42%）、EPI（33%）、5Fu（17%）、DDP（17%）；p73（）的乳腺癌细胞对4种化疗药物敏感性均高于p73
5、（）的乳腺癌细胞（P0.05），p73阳性表达程度与乳腺癌细胞对EPI、5Fu、DDP4种化疗药物的敏感性存在正相关关系（r=0.736,P0.05;r=0.744,P0.05;r=0.674,P0.05;r=0.721,P0.05）.结论：p73的表达与乳腺癌细胞对化疗药物敏感性有关.【关键词】乳腺肿瘤；基因，p73；基因，p53；化疗敏感性0引言乳腺癌临床化疗有效者能显著延长生存期，对化疗药物的抵抗被认为是乳腺癌化疗失败的原因之一.目前对乳腺癌的化疗多是依据临床经验选择相应化疗方案，使治疗存在盲目性，因此有必要寻找一些能对乳腺癌化疗疗效起预测作用的指标，以指导临床化疗提高疗效.我们采用体外
6、培养的人乳腺癌细胞，应用TT法及免疫细胞化学染色法，研究p73,p53表达与乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的关系如下.1材料和方法1.1材料我院经病理诊断为乳腺癌，术前未经放疗、化疗的手术切除的新鲜癌组织12例，放入不含小牛血清的RPI1640培养液中迅速送往实验室.将表阿霉素(EPI)、丝裂霉素()、5氟脲嘧啶(5FU)、顺铂(DDP)分别用生理盐水配制成母液，再用培养液配成100PP浓度工作液（PP是血浆峰值），正压过滤除菌，20保存.RPI1640干粉培养基（Hylne产品）;四甲基偶氮唑盐（TT,Siga产品）;100L/L小牛血清（杭州四季青）;二甲基亚砜（DS，分析纯为重庆化学试剂厂）
7、；p73兔抗人多克隆抗体（武汉博士德生物公司）；p53鼠抗人Ab、SP试剂盒(北京中山生物技术公司).1.2方法采用机械法获取癌细胞单细胞悬液，先将标本用生理盐水（含青霉素300ku/L、链霉素300ku/L）反复冲洗，去除坏死组织和血凝块，置于无菌平皿中，加入少许培养液，用眼科剪反复剪切成糊状，200目不锈钢网过筛；经台盼蓝染色计数活细胞数95%；以1000r/in离心10in；用RPI1640完全培养液（含100L/L小牛血清、含青霉素100ku/L、链霉素100ku/L）调整细胞浓度为5107/L，接种于96孔板，每孔180L；接种细胞分别加入化疗药液20L（药物终浓度为10,1,0.1
8、PP），每个浓度3个复孔；并设细胞对照组（加细胞不加药）和空白对照组（只加培养液），细胞对照组、空白对照组均加入培养液20L；置37，50L/L的2培养箱培养.使用的药物为EPI，5FU和DDP，并按这些药物分组，每组12例.加药培养68h后，离心去上清，每孔加入RPI1640完全培养液180L,TT溶液20L再培养4h，离心去上清，加入DS200L，震荡15in使沉淀充分溶解，用酶标仪（600n）测每孔吸光度（A）值，按下列公式计算相对抑制率：相对抑制率=（A对照-A加药）/A对照100%.根据0.1PP浓度时的相对抑制率判定肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，相对抑制率30%为不敏感，30%50%
9、为敏感，50%为中度敏感.将肿瘤细胞涂于载玻片，晾干后用950L/L的酒精固定，置4冰箱备用.p73、p53免疫细胞化学按照SP试剂盒说明书操作.细胞质内出现棕色颗粒为p73阳性细胞，p53阳性细胞为细胞核内出现棕黄色颗粒；参照文献1标准：无阳性细胞或阳性细胞数10%为（），阳性细胞数10%50%记为（+），阳性细胞数51%75%记为（），阳性细胞数75%记为（）.阳性细胞数10%均视为阳性表达.统计学处理：实验结果以xs表示，采用SPSS11.5统计软件进行t检验、spearan等级相关分析等统计学处理.P0.05视为差异有显著性意义.2结果2.1乳腺癌细胞体外药物敏感性检测10PP浓度时乳
10、腺癌细胞平均相对抑制率为EPI（7014）%,（7411）%,5FU（637）%,DDP（6512）%；1PP浓度时为EPI（4510）%,（475）%,5FU（447）%,DDP（456）%；0.1PP浓度时EPI（267）%,（298）%,5FU（246）%,DDP（258）%；随着药物浓度的升高，4种化疗药物对乳腺癌细胞的相对抑制率均逐渐升高.在0.1PP浓度时乳腺癌细胞对4种化疗药物敏感率分别为42%,EPI33%,5FU17%,DDP17%.2.2p73、p53表达与体外药物敏感性的关系乳腺癌细胞对4种化疗药物的敏感性均与p73的表达相关，p73阳性表达的肿瘤细胞对4种化疗药物敏感性
11、高于p73阴性表达的肿瘤细胞（Tab1）；p73的阳性表达程度与对EPI,5FU,DDP4种化疗药物敏感性存在正相关关系（r=0.736,P0.05;r=0.744,P0.05;r=0.674,P0.05;r=0.721,P0.05）.p53的阳性表达程度未能显示出与乳腺癌细胞对4种化疗药物的敏感性相关（P0.05,Tab1）.表1乳腺癌细胞p73,p53表达与对化疗药物相对抑制率的关系（略）3讨论本结果显示，随着化疗药物浓度升高，乳腺癌细胞的相对抑制率也逐渐升高，对药物的敏感率也逐渐升高；,EPI作为较敏感的药物有不敏感的个体，5FU,DDP作为不敏感药物也有敏感个体，有4例乳腺癌细胞对4种
12、化疗药物均不敏感.可见化疗个体化原则的重要性.p73能通过诱导p21蛋白生成等途径促进凋亡1.Gng等2发现顺铂能通过Abl激酶途径延长p73蛋白的半衰期，增强p73促进凋亡的能力；Trung等3发现化疗杀死p53阴性的肿瘤细胞能被Abl或p73途径激活所加强.Zhu等4研究显示p73能增强由化疗药物诱导的F7细胞株的凋亡，能与顺铂等DNA损伤剂共同诱导p53靶基因的产生，能以依赖p53基因的途径在F7细胞株中联合DNA损伤剂导致凋亡诱导的加强.何勇等5利用脂质体转染技术将野生型p73基因导入p53基因纯合缺失的人肺腺癌细胞株H1299，发现p73基因表达增强可以使肺腺癌细胞对DNA损伤剂化疗
13、药物的敏感性显著升高.另外，我们未发现p53表达与乳腺癌对化疗药物敏感性之间的相关性，究其原因可能是化疗诱导的肿瘤细胞凋亡包括p53依赖和非p53依赖两条途径，Ki等6发现detaxel可通过诱导转录因子AP1，激活其下游的gadd153，p21AF1等来诱导胃癌细胞凋亡，且凋亡的发生与p53突变状态无关，因而认为化疗药物诱导的的非p53依赖性的胃癌细胞凋亡可能是通过AP1介导的.【参考文献】1eberA,BellannU,BtzF,etal.Expressinfp53anditshlguesinpriaryandreurrentsquausellarinasftheheadandnekJ.I
14、ntJaner,2002;99(1):22-28.2GngJG,stanzA,YangHQ,etal.ThetyrsinekinaseAblregulatesp73inappttirespnsetisplatininduedDNAdaageJ.Nature,1999;399(6738):806-809.3TrungT,SunG,Drly,etal.dulatinfDNAdaageinduedapptsisbyelladhesinisindependentedlyediatedbyp53andAblJ.PrNatlAadSiUSA,2003;100(18):10281-10286.4ZhuJ,N
15、zellS,angJ,etal.P73peratesithDNAdaageagentstindueapptsisinF7ellsinap53dependentannerJ.ngene,2000;20(30):4050-4057.5何勇，范士志，蒋耀光，等.P73基因对人肺腺癌细胞H1299化疗敏感性的影响J.癌症，2004;23（6）：645-649.HeY,FanSZ,JiangYG,etal.Effetfp73genenhesensitivityfhuanlungadenarinaellsH1299J.aner,2004,23(6):645-649.6KiR,hiY,InueH,etal.TaxtereativatestransriptinfatrAP1inassiiatinithappttielldeathingastrianerelllinesJ.AntianerRes,1999;19(6B):5399-5405.
