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1、酶的溶胶凝胶固定化技术陈岩摘 要 酶的溶胶凝胶固定化技术以其温和的反应条件，较好的酶活收率而受到 日益广泛的关注。本文概括介绍了这种酶固定化技术的过程，条件及优点。关键词 溶胶凝胶 固定化 酶Eneyme is Imnmbilized by Sol-GelChen YanAbstract Eneyme is imnmbilized by sol-gel is kind for the facik neaction condition moneonerThe activity Heneymes is aways rerernecl The process thectian condition a
2、nd adventepes of sol-qel technique and neproted in this paper Keywords sol-gel， immobilizatien，enzyme酶作为一种天然高活性，高选择性的催化剂，使许多难以进行的有机化学反应在 酶的催化下能顺利进行，而且避免或减少副反应的发生。更重要的，无污染物质产 生，属于绿色催化剂，酶以其如此之多的优点，近年来倍受化学工作者的青睐。但是 目前认为酶是一种蛋白质，稳性较差。在过热，强酸，强碱，有机溶剂等条件下，都 能发生蛋白质的变性，使酶失去催化效能。即使在最佳酶反应条件下，也往往会很快 失活，且酶在反应后，也不
3、能回收，造成重大浪费（难以回收）。目前常用的固定方 法分为三类4：（1）吸附法，它是最简单的方法，适用于各种试剂，但由于试剂与基 质之间的作用力较弱，被吸附的试剂容易洗脱，此点也就限制了催化剂的寿命应用 性；（2）共价键合法，此法固定的试剂一般比吸附法寿命长，但用此法固定试剂较复 杂和费时，有时由于被固定的试剂与基质形成的共价键使试剂的自由度减少而导致试 剂的响应降低；（3）包埋法，试剂被物理的包裹在多孔的机制中，方法简单且适合各 种试剂，只要控制适当的包埋步骤，此法固定的试剂不会洗脱或洗脱很慢。于是酶的固定化技术便成为人们关注的焦点。也是本实验的重点。根据实验要 求，酶固定化之后必须满足以下
4、条件1： 1 固定化之后的酶仍能维持良好的生物活性和反应专一性；第53页2002年12月2 能适应各种酶固定化前的环境，甚至更为苛刻的环境；3 固定后易于回收，有良好的稳定性和耐用性； 4 减少酶组分的相互作用，保持其原有选择性。基于以上几点因素，sol-gel法对酶的固定化采用机聚/无机合物包埋，使用有机聚 合物包埋法。包埋法是将酶包埋于聚合物胶，膜或活性剂基底中，是较为直接，更为 接近生物体的一种固定化技术。该方法简单，适用于各种试剂，只要控制适当的包埋 步骤，此法固定的试剂不会洗脱或洗脱很慢。目前，有机高分子基质已被广泛应用。在本实验中使用酶的溶胶凝胶固定化技术将酶固定。溶胶凝胶玻璃是烷
5、氧基硅烷 （Si（och3）4）常温下分解和缩聚而成的透明玻璃状物质。整个凝胶过程分下列四 步：2，31. 混合：将适当的烷氧化物（Si （OCH3）4）与水，酸性或碱性催化剂和共溶剂在搅 拌或超声波下形成溶液， 水解导致硅醇官能团的形成。 （Si（OcH3） 4） +4H2O+H4SiO4+CH3OH；2. 凝聚：硅醇基继续反应形成硅烷聚合物；3. 老化：将凝胶浸于液体中一段时间（几小时或几天）在老化过程中聚合反应继 续，凝胶强度增加。在陈化过程中，凝胶粒子也可能熟化（溶解再沉淀过程）， 这是由于粒子接触时产生不同曲率半径，它们表面溶解度不同。粒子表面是正曲 率，接触颈脖处是负曲率，它所以是
6、负曲率，因为曲率中心在圆粒固相之外，负 曲率处的溶解度很小，所以圆粒表面溶解物质向颈脖处迁移，使曲率逐渐平坦， 颈脖增粗，同时凝胶变硬，强度增大；4. 干燥：溶剂从相互交联的多孔网络中蒸发掉。被固定的试剂一般在形成溶液或凝 胶过程中加入。凝胶干燥时，在表面现象上产生收缩，硬固，同时产生应力，并 可能使凝胶开裂，干燥过程中，包裹在胶粒中的大量液体要排出，凝胶同时收 缩，一般排出液体体积相当于凝胶收缩体积，却往往在干凝胶中留下大量气孔， 既有开口气孔，也有闭口气孔6，它们对以后烧结有一定关系。那么，如何来控制包埋的酶的性质，以达到最佳固定效果呢？ pH值和H2O： Si摩 尔比是最关键过程参数。较
7、高的pH值可加速水解和缩合的步骤，增进硅颗粒的溶解。 因此也就能不断地提供低分子量的硅来促进颗粒的生长，这些条件也增加了去质子化 程度和表面电荷。所以延迟了溶胀和凝胶步骤。这样，较高的pH值可制备较致密的和 较大的构建模块构成的块状产物。呈现出中等的孔径和比表面积；在较低的pH值条件 下。硅颗粒的溶解可忽略，凝胶过程被带有正电荷的质子。化的表面所阻碍。而且由 于酸的催化。产生致密的低表面的材料，这样的条件用来制备小孔径的个体分离膜。 较大的 H2O： Si 摩尔比可加速烷氧化物的水解速率，而降低凝胶速率，因此可增加溶 胶凝胶的孔隙和比表面积，当这一比例小于 4 时，聚合变得更加被缩合速度所控制
8、， 水解慢下来。于是，由于水解烷氧基团的存在，产生含有大量多余的有机物质残留的 链状的高分子结构。对于本实验所固定的酶，属于大分子有机物，而且需要和反应物 有较充分的接触，因此所需固定环境大致为较高pH值和较低H2O： Si摩尔比。与其它酶的固定化剂技术相比较，溶胶凝胶技术具有以下优势：1 硅酸盐基本抑制了被包埋的大分子的分子间相互作用，基质相对于被包埋的 蛋白质来说相当于一种固体溶液，这种自由度的降低以及凝胶低浓度的敏感来试剂， 将单个的酶分子彼此隔离开来，这就导致了凝胶基质内部发生的反应是在单个蛋白质 分子水平上的。2 酶包埋在溶胶基质中不属于共价键结合，无须蛋白质有特殊的官能团。而且 该
9、包埋法在功能上是非侵害性质，可保存蛋白质表面，微结构的完整性和方向一致 性。3 酶被溶胶凝胶固定化后，寿命增长，这是由于固定基质的稳定化作用及试剂 与孔隙内表面的硅醇基团的相互作用。以上，便是我对酶的溶胶凝胶固定化技术的一点浅显认识，由于水平有限，其中 疏漏错误之处在所难免，请各位老师，专家不吝赐教。参考文献1 李清文，王义明，罗国安。溶胶技术在生物传感器中的应用，化学通报 2000.52 Sakks.s.J. Non-cryst.solids ，1982，48：313 Gonzaloz-oliver CJR.J.Non-cryst.Solicl 1982，48：1294 Denk w,Sri
10、cher J H. Webb W W.Towphoton laser scanning Science 248：73765 W.Geffcken and Berger.German Patent，736411（May1939 ）6 J Zarzycki. J.Non-crystalline Sollids，1982，48：105指导教师评语 陈岩同学在阅读了国内外相关文献的基础上，在教师和研究生指导了认真进行了文章写作，论文 条理较为清晰，层次较为分明，文笔较为流畅。指导教师：姜忠义作者简介陈岩 男，吉林省长春市人，化工学院 2000 级（本科）化学工程与工艺三班。自从参加化工学院科 协举办的走进实验室活动，接触了一些化工前沿科学。在这期间，在姜忠义老师、吴洪老师和许松伟 学长的指导下，受益匪浅，在此表示衷心感谢
