微生物检验规范

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1、微生物检验规范1. 目的明确微生物检验方法和监控标准， 规范微生物检验的各项操作， 通过对原料、产品及生产线各要求环节进行微生物测试， 从检测结果来判定原料、 产品及生产线微检监控点的微生物情况是否符合公司和国家规定的标准，确保产品品质。2. 适用范围公司所有需要作微生物检验的原料、每批产品及微检监控点。3. 职责品保微生物检验员负责微生物检验实验器材和无菌室的准备工作。品保微生物检验员负责原料和生产线微检监控点的微检样品抽样、 保存、 登记和微生物检测工作。成品制程人员负责成品微检样品的抽样工作， 品保微生物检验员负责成品微检样品的保存、登记和微生物检测工作。品保微生物检验员负责出具检测报告

2、并作出符合性判定。品保科长负责微生物检测报告的审核。4. 作业程序实验器材4.1.1 实 验器材、 培 养基和试 剂1 超净工作台 2 恒温培养箱36 13 低温培养箱25- 284 恒温水浴锅46 15电子/ 托盘天平（精确到0. 1g ）6高压蒸汽杀菌锅7烘箱8酒精灯9记号笔10 打火机打火机11银子12 药匙药匙13.生物滤膜14 培养皿9cm/6cm15.锥形瓶300ml/500ml+ 硅橡胶塞16 试管试管17小发酵管18 试管架试管架19接种环20 显微镜显微镜21 塑料篮子22 移液管1ml 、 5ml、 10ml23.膜过滤设备24.医用不锈钢剪刀培养基和试剂1总菌数培养基总菌

3、数培养基平板计数琼脂培养基2大肠菌群培养基大肠菌群培养基结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） 、煌绿乳糖胆盐（ BGLB）3.霉菌、酵母菌培养基虎红培养基4氯化钠氯化钠6乙醇乙醇7二氧化氯粉剂二氧化氯粉剂8.过氧乙酸微生物检验的前准备检验所需器具的灭菌4.2.1.1 培养皿及移液管的干热灭菌洁净干燥的培养皿，倒放于专用培养皿铁筒内，洁净干燥的移液管，尖端朝下，置于移液管专用的铁筒内，把铁筒放在烘箱中，于120c干热灭菌120分钟后，调至160- 180C干热灭菌120分钟后，关掉烘箱，自然冷却至 60c以下，方可打开烘箱门取出置无菌室冷却备用。锥形瓶及移液管的湿热灭菌洁净的锥形瓶，塞上硅橡胶塞并用

4、牛皮纸包扎好瓶口，洁净的移液管，用牛 皮纸包扎完善后，置于蒸汽灭菌锅中，于 121c湿热灭菌20分钟即可。银子、接种环等的火焰灭菌接种环、银子要在酒精灯上须灼烧过方可使用；稀释操作时试管口应在火 焰上方；培养基容器口边在火焰上方。化学灭菌（75%酉精、100X 10-6ClO2）无菌超净台，手部及不能加热灭菌的 PE或塑胶制品，桌子等需用化学灭菌 法；操作台、桌子、凳子、地面在使用完后均用100X 10-6 C1O2擦洗灭菌。培养基及其缓冲稀释液的配制和湿热灭菌%生理盐水的配制称取2.25g氯化钠，溶于250ml蒸储水中，经湿热灭菌即可。4.2.2.2 75%酒精的配制取375ml无水酒精，则

5、需加水 375/=125ml4.2.2.3 培养基的配制和灭菌条件测定项目培养基名称培养基量/1000ml蒸储水杀菌条件菌落总数平板计数培养基121c X 15 分钟大肠菌群结晶紫中性红胆盐琼脂煮沸灭菌2分钟大肠菌群煌绿乳糖胆盐40g121c X 15 分钟霉菌醉母虎红培养基35g121cx 20 分钟灭菌完全后的培养基置于 461C的水浴锅中，待培养基的温度降至 461C方可用.湿热灭菌的步骤：(1)检查蒸压釜中有否足够的水。(2)检查所有载有液体瓶子的螺旋盖(或塞)是否有松动。(3)检查各待灭菌物品是否已用牛皮纸包裹完善。(4)小心地关好杀菌釜的盖/门。除非每个锁都已彻底锁紧，否则不得加压

6、。(5)检查排气道或排气阀是否打开。(6)加热，使所有空气从排气道中随着蒸汽自动排出。 蒸汽要猛烈排放2-3min, 以保证蒸压釜内冷空气全部排出。关闭通风阀或排气阀。(7)继续加热，至达到预定压力及温度。设备和培养基将在121c下维持20min, 以进行灭菌。所需压力要连续维持一定时间。(8)所需加热时间一过，停止加热。在排气阀不打开的情况下让压力自动下降 到零。否则不要打开蒸压釜。当压力为零时，小心打开排气阀，待蒸气排 尽后，打开蒸压釜盖，让它敞开几分钟以泄去多余的热蒸汽，并将釜内原 载有的物品充分冷却。(9)取出釜内原载有培养基或生理盐水的瓶子， 将这些瓶子存放在无菌室的传递箱中待之冷却

7、备用。灭菌完成后的培养基，温度降至46 1C方可使用。所有灭菌完成后的物品，在使用前都必须保持包裹完善无破损的状态。4.2.3无菌室及超净台的灭菌4.2.3.1 每天实验前、后把无菌室地面及超净台打扫干净， 每天用100X 10-6 C1O2 消毒桌面、地面。每月用2%氧乙酸熏蒸。4.2.3.2 实验结束后打开紫外灯对无菌室空间和表面进行杀菌1小时。4.2.3.3 实验前，提前1小时打开超净台紫外灯及无菌室紫外灯。 关掉紫外灯后， 打开无菌室和超净台通风装置，30分钟后，即可进行实验操作。.样品的抽样和判定标准4.3.1实验前应登记样品，给样品编号，记录检验时间、品项、规格、生产日期、 批号、

8、检测项目等，并根据样品数来配制培养基。样品的抽样和判定标准天然水的产品名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准产品品项抽样频率检胎项目检验方法检验标准检验时间550m1/1.25L天然水正常：1瓶/2小时/线开(关)机：2瓶/线幺喃总数滤膜法W 50 个/100ml恒温室放置天后隔驳大肠菌群霉菌酵母滤膜法 滤膜法不得检出W 20 个/100ml细菌百胸GB-478920 个/mlGB-4789W 5 个/ml备注：按抽样频率，检验方法一半采用 GB-4789, 一半采用滤膜法。生产线微检监控点的样品的抽样和判定标准各监控点名，抽样量、检测项目、频率、方法、标准线别监控点检验项检验方标准规定检验频

9、率目法水处理源水菌落总数取合适 的稀释 倍数做 滤膜法监控项目1次/周大肠菌群霉菌醛母砂滤出水，碳罐出水菌落总数取合适 的稀释 倍数做 滤膜法监控项目1次/维护后大肠菌群霉菌醛母精滤出水菌落总数取合适 的稀释 倍数做 滤膜法监控项目1次/天大肠菌群霉菌酵母RO臾系统出水菌落总数滤膜法010cfu/100ml1次/维护后大肠菌0cfu/100ml群霉菌醛母05cfu/100ml精滤UV后出水菌落总数滤膜法050cfu/100ml1次/天大肠菌群0cfu/100ml霉菌酵母50cfu/100ml膜出水、膜产水储罐、兑制水储罐、兑制水UV后、菌落总数滤膜法10cfu/100ml1次/天大肠菌群0cf

10、u/100ml霉菌酵母5cfu/100ml氧化塔出水、洗瓶水菌落总数滤膜法3cfu/100ml1次/天大肠菌群0cfu/100ml霉菌酵母0cfu/100ml灌装头（开机前）菌落总擦拭法2个/每灌装头1次/周水线灌装头数霉菌酵母5个/每灌装头洗瓶头（开机前）2个/每洗瓶头洗瓶头5个/每灌装头封盖头 5 个/10cm2盖滑槽 5 个/10cm2拨盖星轮 5 个/10cm2盖贮存槽 5 个/10cm2盖斗5 个/10cm2盖输送带5 个/10cm2洗瓶夹 5 个/10cm2门内壁 20 个/10cm2充填槽外壁或顶部 20 个/10cm2风送轨道 20 个/10cm2输送带（接近灌装机） 20 个

11、/10cm2冲洗后空瓶平均02个/瓶蛊卜滑道中盖平均02个/盖操作人员手部 50个/双手操作人员衣服人250 个/10cm微生物检测方法4.4.1 滤膜法 : 适用于进行滤膜法检测的各种微检样品。4.4.1.1 仪器：冰箱：04C；恒温培养箱：36 1C/25-28 C；恒温水浴锅：461C；电子 天平：精确至；灭菌平皿：直径60mm 90mm膜过滤设备；滤杯；滤膜；超净工作台；真 空泵；高压灭菌锅；灭菌的剪子、镊子、玻璃瓶及其它物品。4.4.1.2 试剂与培养基平板计数培养基、虎红培养基、煌绿乳糖胆盐培养基， 养基、 虎红培养基、%生理盐水，121灭菌20min；结晶紫中性红胆盐琼脂煮沸灭菌

12、 2min； 75%aL酉I; 100Ppm二氧化氯。4.4.1.3 操作步骤 :（ 1）将样品摇匀，取100ml 倒入膜过滤装置中，打开抽滤泵，开始抽滤，抽干滤液后关上抽滤泵。（ 2）将镊子在火焰上灭菌，膜用灭菌过的镊子取下，在火焰旁正面贴于预先制备的培养基平皿中， 平板计数琼脂培养基用于培养菌落总数， 虎红琼脂培养基用于培养霉菌和酵母菌，VRBA培养基用于培养大肠菌群，膜下避免出现气泡。（ 3）培养a.菌落总数：倒置于36 1C的恒温箱中，培养 48h 2h。菌落总数以实际菌数报告之，单位为 cfu/100ml 或 cfu/ml 。b. 霉菌和酵母菌：倒置于25- 28恒温箱中， 3d 后

13、开始观察，共培养观察5d。菌落总数以实际菌数报告之，单位为 cfu/100ml或cfu/ml。c. 大肠菌群倒置于361C的恒温箱中，培养18h-24h。取出平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色， 菌落周围有红色的 胆盐沉淀环，菌落直径为或更大。从VRBAF板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，361C培养24h48h,观察产气情况。凡BGL的汤管产气， 即可报告为大肠菌群阳性。大肠菌群平板计数的报告： 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以中计数的平板菌落数， 再乘以稀释倍数， 即为每 100ml 样品中大肠菌群数。例：在VRBAF板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB 肉汤管，证 实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为： 100X 6/10/100ml=60cfu/100ml。4.4.2 国标法： 适用于不能用滤膜法检测的各种微检样品以及规定用国标法检测的样品。4.4.2.1 菌落总数4.4.2. 设备与材料：冰箱：04C；恒温培养箱：361C；恒温水浴锅：46 1C；电子天平：精确 至；灭菌吸管；灭菌平皿：直径 90mm 60mm超净工作台；高压灭菌锅及其它 物品。4.4.3. 培养基与试剂：平板计数琼脂培养基，%柱理盐水，121c灭