叶绿素的提取与含量测定

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1、沖尹丿洋实验报告课程名称：植物生理学实验指导老师:成绩：实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 实验类型:同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）三、实验材料与试剂（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 七、实验结果与分析（必填） 二、实验内容和原理（必填）四、实验器材与仪器（必填）六、实验数据记录和处理八、讨论、心得一、实验目的和要求：1. 掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定。2. 掌握定量分析的原理和方法。二、实验内容和原理：以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下：1. 叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用

2、95%的乙醇或80%的丙酮提取。2. 皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的 类胡萝卜素分开。3. 取代反应。在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+，可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的 去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。4. 叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。5. 定量分析。叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素 a,b及总量，而652可直接用于总量分析。三、实验材料与试剂材料：青菜叶试剂：KOH固体、醋酸铜粉末、醋酸四、主要仪器设备：1天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机2 .

3、研具、PE管、酒精灯等五、操作方法和实验步骤（必填）1. 定性分析：荧光现象：鲜叶3-5g+95%乙醇15ml （逐步加入），磨成匀浆，过滤入三角瓶，观察荧光现象 皂化反应：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和1ml，分层后观察取代反应：加醋酸约1ml,观察颜色，取1 /2加醋酸铜粉，加热变亮绿色2叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD 0.5-1），在400-700nm处扫描光谱，分别测定 类胡萝卜素的吸收峰反复用石油醚粹取，直到无类胡萝卜素，离心得叶绿素（盐），（稀释663nm OD 0.5-1），分别测定叶绿素的吸收峰3叶绿素定量分析：鲜叶

4、O.lg，加1.9mlH2）,磨成匀浆，取2份0.2ml力加 80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上 清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb和Chl总量的值。六、实验数据记录和处理1. 荧光现象：透射光皇色，反射光亘光皂化反应分层3.类胡萝卜素和叶绿素的吸收光谱测定: 上层黄色溶液扫描光谱2. 皂化反应：上层呈黄色,为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。 下层呈绿色。为叶绿素。吸收蓝紫光和红光。吸收峰为 468nm、439nm、413nm、667nm 和 606nm 五个 下层绿色溶液扫描光谱去镁叶绿素铜代叶绿素吸收峰为414nm、526nm、639nm三个4.取代反

5、应：加醋酸约1ml，变褐（去镁叶绿素）取1/2加醋酸铜粉加热变亮绿色，为铜代叶绿素。5.叶绿素含量测定波长/nm吸光度（第一组）吸光度（第二组）6450.0680.0726520.0930.0956630.1640.170根据公式：C=12.7OD -2.69 ODa(mg/L)663645C=22.9OD -4.68 ODb(mg/L)645663C= OD X1000/34.5T(mg/L) 652Chla 含量(mg/g.FW)= (C /1000)x2/ 0.1 x5/ 0.2a(mg/L)Chlb 含量(mg/g.FW) = (C /1000) x2/ 0.1 x5/ 0.2b(mg

6、/L)Chl 总含量(mg/g.FW) = (C /1000) x2/ 0.1 x5/ 0.2T(mg/L)求得：C = 1.899 mg/La1C =0.790 mg/Lb1C =2.696 mg/LT1Chla 含量 1 =0.950 mg/g.FWChlb 含量 1 =0.395 mg/g.FWChl 总含量 1=1.348 mg/g.FWC=1.965 mg/La2C=0.853 mg/Lb2C=2.754 mg/LT2Chla 含量 1 =0.982 mg/g.FWChlb 含量 1=0.426 mg/g.FWChl 总含量 1=1.377 mg/g.FW七、实验结果与分析类胡萝卜素

7、和叶绿素的吸收光谱测定：类胡萝卜素的吸收峰为蓝紫光区468nm、439nm、413nm三个峰，在红光区667nm和606nm 的峰说明叶绿素有残留。叶绿素在蓝紫光区有414nm、526nm两个峰，在红光区有639nm 一个峰，蓝紫光区的峰比红光 区的高，说明叶绿素吸收蓝紫光的能力比红光强。叶绿素含量测定：Chla 含量 1 =0.950 mg/g.FWChlb 含量 1 =0.395 mg/g.FWChl 总含量 1=1.348 mg/g.FWChla 含量 1 =0.982 mg/g.FWChlb 含量 1=0.426 mg/g.FWChl 总含量 1=1.377 mg/g.FW两组测定结果

8、中叶绿素a与叶绿素b含量之和与用663nm求得的总叶绿素含量比较接近,说明实验结果 较为理想，可能造成实验误差的因素有：1. 研磨后的叶绿素溶液中仍存在固体,可能堵塞移液枪管口,造成吸入的溶液量不准确2. 比色皿未清洗干净,造成测得的吸光度改变3. 分光光度计存在仪器误差八、讨论、心得思考题：1为什么叶绿素吸收红光和蓝紫紫光？叶绿素的能级有基态（G）,第一单线激发态（E1）,第二单线激发态（E2）和三线激发态（E3）,光 子吸收必须遵守普朗克定律,被吸收光子的能量必须等于基态和激发态的能量差。蓝紫光能量大,可使 叶绿素分子中的电子跃迁到E2,而红光能量小，只能使其跃迁到E1，故叶绿素只能吸收蓝

9、紫光和红光。 2为什么可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱？因为由于叶绿素皂化反应后的叶绿素盐并不影响叶绿素分子的骨架结构，叶绿素对光的吸收规律与 叶绿素盐对光的吸收规律几乎是相同的，而且皂化反应可以从叶绿体色素中只筛选出叶绿素，排除了其 他色素的干扰，所以可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱。讨论：1. 皂化反应后的黄色溶液需用石油醚萃取多次，如果萃取补充分，会有叶绿素残留，在扫描吸收光谱 时除了在 468nm、439nm、413nm 有吸收峰，在 667nm 和 606nm 也会有微弱的叶绿素吸收 峰。2. 在测定用皂化反应分离的叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱前，需将溶液稀释至 (470nm/663nm)OD 在0.5-1 之间，如果浓度过高，峰值可能会超出仪器的测量范围， 将无法测得吸收峰。