《实验二 琼脂糖凝胶电泳实验》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验二 琼脂糖凝胶电泳实验（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验二 琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】（1）学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；（2）掌握使用水平式电泳仪的方法；（3）学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。【实验原理】琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为PH2-2.5，在常规 的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有 电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比， 分子越大则所受阻力越大，也越难
2、于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时，它在电场中移动距离不仅和分子量有关还和它本身构 象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得 最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象 引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然 后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。（3）电源电压。在低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的
3、增加， 不同分子量的 DNA 片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因 此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超 过 5v/cm。（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误 用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10X电泳缓冲液），则电 导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。溴化乙啶（Ethidium bromide, EB） （1）能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外
4、光照射下EB 能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓 度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适 用于RNA的分离鉴定和Northern杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样， 因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放 射性标记的探针发生高效杂交。【试剂与器材】（一）材料 电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂
5、糖等（二）试剂1、： 242gTris,50惻57qmm1冰醋酸，18.6g EDTA。2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。3、 DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。4、 RNA甲醛变性胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，1mM EDTA（PH8.0），50%甘油（w/v），用DEPC水 配制，高压灭菌备用。5、甲醛变性胶电泳缓冲液：0.1m MOPS（PH7.0）, 40mM醋酸钠，5mM EDTA（PH8.0），用DEPC水配制，过滤除菌， 室温避光保存。淡黄色缓冲液可正
6、常使用，深黄色应弃用。【操作方法】（一）常规的水平式琼脂糖电泳1 /3制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表:琼脂糖的含量（）分离线状DNA分子的有效范围（Kb）0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.11. 制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热 过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。2. 胶板的制备：将胶槽置于制胶板上插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底
7、面保持1mm左右的间隙，待 胶溶液冷却至50C左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB（也可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用0.5p g/ml 的 EB 溶液浸泡染色 15 分钟），摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将 凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；3. 加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于IX。用10 p L微量 移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔 周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点
8、样量）。4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖 浓度低于 0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效 分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。5. 观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有EB的电泳胶板。 DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。（二）在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳（选做）配制23 mL甲醛电泳胶：0.336g琼脂糖溶于20mL DEPC水中，冷却至
9、 ，加入5mL的5x甲醛变性胶电 泳缓冲液和5.5mL的甲醛，在通风橱内倒胶，冷却30分钟后使用。甲醛变性胶RNA样品的制备：1 RNA,甲醛变性胶电泳缓冲液0.5,甲醛0.7,甲酰胺2, 65oC加热15min，迅速冰浴，加1上样缓冲液和0.2阴的 EB。步骤：1. 用 3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上。2. 胶板的制备：按常规琼脂糖电泳法。3. 预电泳：1X甲醛变性胶电泳缓冲液，预电泳10 min。电压为5V/cm。4. 小心地进行点样，记录样品次序与点样量；然后开始电泳，电压为3-4V/cm。5. 观察和拍照：在波长为 254nm 的紫外灯下观察电泳胶板并拍照保存图片。【注
10、意事项与提示】（1）EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾 污了 EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL 以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L的 亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。（2）由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该
11、采用跑完电泳后再用0.5“g/ml的EB溶液浸泡染色的方法。（3）总RNA的分析：哺乳动物的RNA由28S rRNA、18S rRNA和mRNA以及其它小分子RNA组成，28S和18S rRNA 处为明显的亮带（相当于4.5kb和1.9kb）, 28S/18S应为1.5-2.5/1；植物、昆虫、酵母和两栖动物的RNA带分布较 小，约为0.5-3.0kb左右；假如28S/18S小于1/1，或者出现拖带，说明RNA已经有部分降解，如果28S和18S rRNA 大部分已降解，则需重新制备。【实验安排】 只需一天：上午配试剂倒胶，下午跑电泳并观察拍照。【实验报告要求与思考题】 1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）M： 1Kb DNA ladder； 1：质粒 DNA2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？电泳流程图：
