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1、莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法的建立刘道峰;邓省亮;赖卫华;夏骏【摘要】A composition,with a stable character and uniform size,and which contains fluorescent microspheres as a novel label, was obtained successfully by a EDC one-step method. A fluorescent lateral flow assay for detecting ractopamine which has high sensitivity(LOD ava
2、ilable is 2. 5 ng/mL) , satisfying specificity and a wide range for detecting was developed based on this composition as probe. The method of fluorescent microspheres lateral flow assay is more sensitive than that of colloidal gold lateral flow assay. The novel fluorescent microspheres do contribute
3、 to improve the sensitivity of immu-nochromatographic assay.% 以荧光微球作 为新型标记物，采用EDC法进行偶联，制备莱克多巴胺抗体荧光微球复合物,复合物 粒度均一、性质稳定,并以之为探针建立莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法,检 测限为2.5 ng/mL,且特异性强、检测范围宽与胶体金免疫层析方法相比，荧光微球 免疫层析方法的灵敏度更高,新型的荧光微球可以提高免疫层析方法的灵敏度.【期刊名称】 食品与机械【年(卷),期】 2012(028)001【总页数】5页(P73-77)关键词】 荧光微球;莱克多巴胺;免疫层析;检测作 者】 刘
4、道峰;邓省亮;赖卫华;夏骏【作者单位】南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;江西省 科学院微生物研究所,江西南昌330029;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室, 江西南昌 330047;江西省兽药饲料监察所,江西南昌 330029【正文语种】中文莱克多巴胺(ractopamine, Rac )是一种属于苯胺类的p-受体激动剂，主要以 盐酸盐形式存在。其具有重新分配机体营养、抑制脂肪沉积、提高蛋白质含量、增 加酮体瘦肉率、改善肉质以及促进动物生长的作用1-3。因此，近年来在经 济利益的驱使下，大量莱克多巴胺被滥用于畜牧业和养殖业。人体摄入Rac的量 过大时，会导致一系
5、列不良反应，主要有肌肉震颤、心跳和呼吸加快等，严重的会 危害生命。鉴于此，许多国家已经禁止将莱克多巴胺作为饲料及饲料添加剂使用。如欧盟于1996年便明令禁止在畜牧生产中使用包括莱克多巴胺在内的所有P-肾 上腺素兴奋剂类药物，中国农业部亦于2002年明确将其列入禁止在饲料和动物 饮用水中使用的药物品种目录。目前，检测莱克多巴胺比较经典的方法有高效液相色谱-质谱联用法(HPLC - MS)4、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)5、高效液相色谱法 (HPLC)6,这些都是比较传统的办法，亦是目前的确证方法7,8。另 外，目前常用的还有酶联免疫(ELISA )9 的方法。但由于以上方法均需先进 检测仪
6、器、检测费用昂贵、步骤繁琐、耗时,且对操作人员专业性要求较高,不适 用于基层企事业单位的大通量快速筛查检测。因此,研究莱克多巴胺的快速筛查方 法有重要的意义。荧光微球(fluorescent microspheres , FMs )是指将荧光染料通过物理和化学 等方法吸附或包埋到粒子内而形成的，直径在纳米至微米级(0.01 10pm )范围 内,受激发光源激发能发出荧光的固体微粒。相比胶体金等传统标记物(须大量聚 集才会被辨别出10），它的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以 荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限。在微球壳结构的作用下，荧光微球 具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分
7、散性好、稳定性好、发光效率高、重复 性好，有较好的生物相容性11。形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强 而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响12。因此，荧光微球作为标记 物的免疫层析技术有较高的研究价值与前景。本试验以荧光微球作为标记物，初步 建立了一种快速、灵敏的现场检测方法。莱克多巴胺、西马特罗、特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、OVA :美国Sigma公司；BSA :瑞士 Roche 公司；1-乙基-（3 -二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）:上海国药集团化学试剂 有限公司；NC 膜：CN140,德国 Sartorious 公司；荧光微球（52.9 mg/m L,表面羧基400 nm
8、ol /mg）、Anti - Rac单克隆抗体、Rac全抗原、胶体金、免疫微球复溶液：江西中德生物工程有限公司。点喷系统：BIO - DOT XYZ - 3050 ,美国 BIO - DOT 公司；荧光分光光度计：F4500,日本Hitachi公司；超细微粒粒度分析仪：ZLS Nicomp380，美国PSS公司；水处理系统：Milli-Q,美国Millipore公司；可编程切条机：HGS - 201,浙江杭州峰航科技有限公司；高速冷冻离心机：H - 2050R，湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司；磁力搅拌器,HJ -6,江苏金坛吉特仪器厂；真空干燥箱：DZX - 6090B，上海福玛实验设备有限公
9、司。1.3.1免疫微球合成及表征以5 m L标记体系分别标记30,40,50pg/mg（抗 体/微球）的免疫微球，具体方法：烧杯（用前铬酸浸泡3 d，再用蒸馏水洗涤并 浸泡1 d，p H 5.0的PB缓冲液润洗30 min ）中加入定量的PB缓冲液（p H 5.0， 下同），加入荧光微球2.5 mg，快速搅拌下加入相应标记量的抗体（稀释10倍 并缓慢加入），再缓慢加入10 mg/m L EDC 19.2pL（与微球表面羧基摩尔量相 等），保证最终体系体积为5 m L。室温缓慢搅拌反应2 h，再加入500pL 10% （m/m） BSA 封 闭 30 min。8 000 r / min ,10
10、C 离心 10 min，弃上清，并 以PB清洗，相同条件离心，重悬于500pL免疫微球复溶液中,4C保存备用。 另分别取荧光微球和不同免疫荧光微球，多次清洗，超纯水重悬，以超细微粒粒度 分析仪分别测定不同微球粒度及zeta电位，以荧光分光光度计连续扫描各微球荧 光光谱。1.3.2结合垫制备以XYZ3050点喷系统分别将1.3.1步骤中免疫微球复溶液重悬 后的3种荧光微球喷涂到结合垫上，喷涂量4pL/cm,得到不同标记量的3种结 合垫,30C真空干燥2 h，干燥保存备用。1.3.3 Rac NC膜的制备与处理用XYZ3050点喷系统分别在NC膜的适当位置喷 涂Rac全抗原、羊抗鼠二抗形成检测线（
11、T线）和质控线（C线），30C真空干 燥1 h,制成Rac NC膜，干燥环境保存。另取Rac NC膜分别于0.5%BSA （ m /m）、0.5%OVA （m/m ）中封闭10 min，超纯水漂洗残余封闭剂，沥干水分， 30C真空干燥1 h，干燥保存备用。1.3.4荧光微球标记免疫层析试纸条组装分别取1.3.2步骤得到的30,40,50pg / mg不同标记量结合垫与1.3.3步骤所得的BSA封闭、OVA封闭与未封闭的 NC膜，于干燥环境中，依次按聚酯膜、样本垫、结合垫、Rac NC膜、吸水垫的 顺序将各部分粘贴于试纸条PVC底板上，用切条机切成4 mm宽的试纸条，组装 卡壳,干燥保存。1.3
12、.5荧光微球免疫层析检测方法的判定将试纸条平放，滴加样品待检液80pL于 加样孔，5 min后于手持式荧光读取仪中观察。若T线显色(有可见条带)则判 读为阴性，样本中不含Rac或低于检测限；T线不显色(无可见条带)则判读为 阳性，样本溶液中Rac浓度大于检测限。若C线不显色，则判定为试纸条无效。1.3.6 荧光微球免疫层析试纸条参数选取与评价(1)免疫层析最佳参数选取：将 Rac 标品用甲醇溶解，并用 PBS 稀释至 1 000， 100,20,10,5, 2.5，1.25 ng/m L。分别向不同组试纸条滴加以上浓度标品 80pL,同时以PBS作阴性对照，按1.3.5所述检测方法分别判断不同
13、组试纸条显 色情况。择优作为本方法最终条件。(2 )灵敏度及检测范围的测定：Rac标准品以甲醇溶解，PBS调整终浓度为10 000,1 000,100,40,20,10,5,2.5,2, 1.25 ng/m L,将优化后试纸条， 以1.3.5所述方法在Rac浓度010 000 ng/m L间判读结果，每个浓度重复5 次。(3 )方法特异性：用甲醇稀释RAC的结构类似物西马特罗、特布他林、克伦特 罗、沙丁胺醇至1 mg/m L,再用PBS缓冲液稀释至终浓度为1,5,10,50, 100, 500 ng/m L。以1.3.5所述的标准方法检测，每个浓度重复5次，判断试 纸条的检测特异性。(4 )与
14、胶体金方法的比较：参阅文献9 将试验所用Anti - Rac单克隆抗体标 记到胶体金上,按其相应方法优化工艺参数并组装成胶体金免疫层析试纸条。按 1.3.6 ( 2 )方法同时将胶体金试纸条与荧光微球试纸条在Rac浓度为0, 1.25 , 2.5,3,4,5,6,7,8,10,20 ng/m L的添加水平上判断试纸条响应情况及 灵敏度,每浓度3个平行。2.1.1 zeta电位及粒度由图1和图2可知，微球偶联前后在纯水中均带负电荷， zeta电位相对时间均比较稳定；偶联前，微球平均粒径为232.8 nm ,颗粒多分散 性指数(Variance )为0.167。表明所用微球在溶液中性质稳定，颗粒规
15、则、大小 均匀。偶联后zeta电势有所下降，平均粒径有所增大(316.8 nm )，表明由EDC介导 的通过表面羧基的偶联方法成功，多分散性指数依然较小(0.275)，说明得到的 免疫微球颗粒均一，适合作为免疫层析检测探针。2.1.2 荧光微球光学性质经荧光分光光度计连续扫描发现所用微球最大激发波长为462.4 nm，最大发射波长为592.8 nm，说明所用荧光微球有较大的Stokes位移， 意味着在此微球标记的免疫层析检测中激发光及发射光可以更轻松地被分开，背景 干扰较低，故以此微球做免疫层析标记物有较强优势。由图3可知，经过偶联后，不同抗体标记量的微球发射光谱峰型规则，荧光强度 有所降低，
16、但仍与偶联前有相同的峰位，发射谱峰未见漂移。说明偶联后荧光微球 的发光颜色与抗体的标记量无关，偶联过程不会造成微球光学性质的改变。综上所述，偶联后的Rac免疫微球性质稳定、颗粒规则、大小均匀，有较好而且 稳定的光学特性，适合作为免疫层析的标记物。不同标记量与NC膜不同处理方式的试纸条的最低检测浓度见表1。 如表1所示，在所测范围内，降低抗体的标记量，检测灵敏度随之提高，但同时 相应T线条带的清晰度也会减弱。试验中显示，30pg/ mg标记量与40pg/ mg 标记量检测限差异不显著，但相比之下，30pg/ mg标记量阴性(图4(a)与 阳性(图4(b)区分性差，40pg/ mg标记量的阴性两条带更清晰，阴性与阳 性对比明显(图4(c)、图4(d),判读更容易。综合考虑，层析方法选择40pg/ mg抗体标记量的免疫微球。由于NC膜是多孔性网状
