《综合性实验植物DNA的提取及电泳》由会员分享，可在线阅读，更多相关《综合性实验植物DNA的提取及电泳（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、YUNNAN NORMAL UNIVERSITY本科学生综合性实验报告学号：124120434 姓 名：云谣学院：生命科学学院 专业、班级：12生物技术实验课程名称：植物DNA提取质量检测及特定基因片段操作教师：郝大海开课 学期：2021至2021学年上学期师大学教务处编印实验序号实验名称植物DNA提取质量检测及特定基因片段操作实验时间第十五周实验室睿智3-428一、实验目的1、了解植物DNA提取方法，熟悉操作步骤2、掌握植物大分子操作考前须知及试剂用具准备方法3、掌握DNA质量紫外分光光度计检测方法4、了解PCR原理，熟悉操作步骤5、掌握核酸的琼脂糖电泳检测方法二、实验原理1、DNA提取的原
2、那么：1保证DNA 一级构造的完整性2排除其它分子的污染RNA、蛋白质、多糖等2、在浓氯化钠溶液(12mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解 度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白 的溶解度很大因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白 从样品中分别抽提出来.3、别离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3 种：1、用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白 质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相用两倍体积 95%乙醇溶液将DNA
3、钠盐沉淀出来如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游 离的DNA.2、用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸别离，从而从材料中 直接提取出DNA.3、用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相，或存在于中间残留物中， 蛋白变性后那么停留在酚层吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中， 得到白色纤维状DNA沉淀4、DNA提取方法：1CTAB法原理：CTAB十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可 溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。在高盐溶液中0.7mol/LNaCl，该复合物 可溶。之后用有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质，最后在上清液中参 加乙醇沉淀DNA。
4、注意CTAB溶液在低于15C 时会形成沉淀析出，因此在将其 参加冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15C。2SDS 法SDS阴离子去垢剂在高温5565C、下裂解细胞，蛋白变性，染色体离析，在 高盐(KAc或NHc)或降低温度冰浴、使蛋白质及多糖杂质沉淀，之后上清液 中的DNA用酚/氯仿抽提，最后乙醇沉淀水相中的DNA。5、DNA质量检测：紫外分光光度计检测法，嘌吟和嘧啶的母环含有共轭双键，因此也有 紫外吸收现象，且在260nm和280nm处也存在吸收峰。蛋白质中含苯环的氨基酸在这两个波 长下也会发生光吸收。因此，通过260nm和280nm下样品的吸收值比率可判断核酸纯度。6、琼脂
5、糖电泳：琼脂糖凝胶电泳是常用的用于别离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法， 这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应， 到达别离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是 主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。7、PCR实验原理聚合酶链式反响(polymerase chain reaction,PCR),是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列 的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两
6、个寡 核苷酸引物，经变性、退火和延伸假设干个循环后，DNA扩增2n倍。PCR反响的每一个温 度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反响延伸三个步骤完成的。图中设定的反响参数 是94C变性1 min, 60 C退火1 min, 72 C延伸1.5min。如此周而复始，重复进展，直至扩 增产物的数量满足实验需求为止。三、实验设备及材料一、仪器设备1.5ml离心管；5ml离心管；研磨棒；5ml吸头；1000ul吸头盒；200ul吸头盒 10ul吸头盒5ml移液器；1000ul移液器；200ul移液器；30ul移液器；2ul 移液器；试剂瓶；量筒、恒温水浴锅；高速离心机；紫外分光光度计；电泳仪; 电泳
7、槽；酸度计；电子天平；PCR仪二、试剂CTAB； NaCl； Tris； HCl； H3BO4； EDTA； NaOH; PVP；琼脂糖；EB;引物； dNTP； Taq 酶；EB三材料：马铃薯叶四、实验方法步骤一、DNA的提取；1、取10Omg新鲜叶片，置于预冷1.5ml离心管中，参加液氮，研为细粉。参加350皿新鲜2XCTAB缓冲液，再仔细研磨。CTAB用于抽提DNA2、350皿新鲜2XCTAB缓冲液，冲洗研磨棒，参加2皿卩一巯基乙醇，混匀。65C 水浴45分钟，每15分钟摇动一次。冷却至室温，静置2分钟。3、每支离心管参加700皿氯仿：异戊醇24: 1672氯仿:28异戊醇混合液。 轻柔
8、短暂地混和，防止DNA断裂。颠倒几次。氯仿、异戊醇、苯酚都用于沉 淀蛋白质4、在微型离心机中，以14，OOOrpm离心5分钟。移取上层水层，置于新的、 标识好的1.5ml离心管中。注意防止取到中层物质。将氯仿：异戊醇废液倒入废 液缸。5、参加50皿10%CTAB溶于0.7M NaCl，轻柔混和，并保证混和完全。6、重复第3、第4步。7、每支离心管中参加等体积异丙醇400 500皿。上下颠倒几次，4C静置20 分钟或一20C,15分钟。异丙醇用于沉淀DNA8、14，000rpm离心20分钟。小心倒出上清夜，防止DNA颗粒丧失。倒置离 心管，空气枯燥12分钟o9、用1ml70%乙醇清洗DNA3分钟
9、，14,000rpm离心30分钟。小心倒出70% 乙醇，用1ml 90%乙醇清洗DNA，14,000rpm离心30分钟，小心地倒去乙醇。 倒置离心管，空气中枯燥，或用真空泵枯燥15分钟。乙醇用于去除低分子量 寡核苷酸和核苷三磷酸10、以150皿T10E1或蒸馏水溶解DNA，参加12皿 不含DNA酶的RNA酶A 10mg/ml。37C反响 1 小时。11、4C保存一20C长期保存。二、琼脂糖凝胶电泳1、取5XTBE缓冲液20mL加水至100mL，配制成1XTBE稀释缓冲液，待用。2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，参加50mL 1 XTBE 稀释缓冲液，放入微波炉里加热至
10、琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为1%琼脂糖 凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏严密封住。将封好的胶槽置 于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm 左右的间隙。 向冷却至50-60宅的琼脂糖胶液中参加溴化乙锭(EB)溶液使其终 浓度为0.5遽/mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏侧，待琼脂糖 溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽，使胶液形成均匀的胶层。待胶完 全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽参加1XTBE稀释 缓冲液至液面恰好没过胶板上外表。4、加样：取10LD
11、NA样品与2L6X上样液混匀，用微量移液枪小心参加样 品槽中。假设DNA含量偏低，那么可依上述比例增加上样量，但总体积不可超 过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要 小心操作，防止损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。5、电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V， 电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停顿电泳。6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5遽/mL的EB溶液中，室温下染 色 20-25min。7、观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB 的电泳胶板。五、实验考前须知1
12、、EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB 洒到桌面或地面上。但凡沾污了 EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗。 沾染了 EB的垃圾要专门处理后才可丢弃。2、当EB太多，胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30min 后再观察。3、制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否那么凝固不均匀：速度也不可太快， 否那么容易出现气泡。4、CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵），是一种 阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离 子强度的溶液中（0.7mol/L NaCl）,
13、CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不 能沉淀核酸通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后参加乙醇沉淀 即可使核酸别离出来。5、注：CTAB溶液在低于15C时会形成沉淀析出，因此，在将其参加冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15C。6、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质， 有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多 糖；7、蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗 涤蛋白酶处理核酸别离，纯化；8、多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中参加1/2体积的5M NaCl,高盐
14、可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量 的氯苯（1/2体积），氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000 代替乙醇沉淀DNA:在500 DNA液中参加200皿20% PEG8000 （含1.2 M NaCl），冰浴20min.核酸别离，纯化；9、多酚的去除:在抽提液中参加防止酚类氧化的试剂：卩-巯基乙醇、抗坏血酸、 半胱氨酸、二硫糖醇等参加易与酚类结合的试剂：如PVP（聚乙烯吡咯酮）,PEG（聚 乙二醇），它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合；10、盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附，沉淀和溶解使用适宜的吸附材料 吸附核酸，其它的杂质均被洗掉
15、，到达纯化DNA的目的另一种方式参加1/10 体积的NaAc（pH5.2,3M），用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用 70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等假设长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中 的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发 生酸解。七、实验结果及分析一、实验结果纯的 DNA 样品 OD260/OD280 应为 1.8, OD260m/OD230 应大于 2.0。1、OD260/OD280大于1.9时，说明有RNA污染。2、小于1.6时，说明样品中存在蛋白质或酚污染；3、OD260/OD230小于2.0时，说明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷 酸、氨基酸、酚等。注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。只有当DNA的OD260/OD280接近于1.8时才值得去电泳。本次实验的结果为：OD260: 2.6OD280: 1.20D260/0D280=2.6/1.2=2.1电泳结果如下：条带最多的是DNAmark样本，它的围在200-4000之
