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1、常见新生儿疾病动物模型的特点与比较荣箫 周伟近年来，随着产科和新生儿重症监护治疗技术的发展，我国早产儿、低出生体重儿、多胎儿的出生率 有明显增高趋势，新生儿疾病一直是儿科疾病中研究的热点。建立合适的动物模型是研究新生儿疾病的关 键，可以避免在人身上进行实验所带来的风险，本文就目前常见新生儿疾病的各种动物模型的特点作一综 合介绍和比较。一、实验动物的选择：迄今为止，用于建立新生儿疾病动物模型和进行各种相关研究的动物主要包括大鼠、小鼠、豚鼠、新 西兰白兔、绵羊、狗、猪和灵长类动物。大鼠、小鼠、豚鼠、绵羊和新西兰白兔是常规的实验动物，其中 啮齿类动物由于其遗传背景清晰，容易获得，操作简单，重复性好，
2、价格经济，使用最为广泛，可用于发 病机制、药理学及神经行为学等的研究。实验动物的选择通常以实验目的和动物各自的特点来决定。若实 验中需要每天抽取子代血液作为标本，就应选择体形大一些的动物如绵羊，以使用留置导管，为实验提供 方便；若进行以形态学和分子生物学检测技术为基础的实验，则适宜选择体形较小的动物；当需要设窝内 对照时，新西兰白兔则是最佳的考虑对象，因为子兔在孕兔子宫内有着各自的羊膜腔；选用灵长类动物如 恒河猴或猕猴作研究对象的价值在于：此类动物有与人类极其相似的生物学特性和解剖结构；猪的解剖和 生理学与人类较为相似，也成为近年的研究热点。此外，为确保实验结果的准确性和可重复性，应尽量选用与
3、研究内容相匹配的经遗传学、微生物学、 环境及营养控制的标准化实验动物，才能排除微生物的干扰和潜在疾病对实验结构的影响，排除遗传污染 造成的个体差异。二、常见的新生儿疾病动物模型(一)胎儿生长受限(fetal growth restriction , FGR)模型1.子宫血管结扎法：早期的做法是于孕晚期完全结扎妊娠动物的双侧子宫动脉以减少胎儿营养素和氧 的供给1，但这种做法在短时间内完全阻断了子宫动脉的血流，死胎率高，建模成功率相对较低。目前常 用的做法是部分结扎子宫动脉2或部分结扎子宫动脉和子宫静脉3。部分阻断法建立的 FGR 动物模型具有 与人类 FGR 更为类似的病理生理学特点，并且克服了
4、上述死胎率高、发病率低等缺点。但其操作有一定 难度，尤其是部分血管结扎，扎的过紧死胎率太高，扎的过松 FGR 发生率太低。另外，此法是在孕晚期 施加干预,也就无法观察孕早、中期营养供应异常对子代生长发育的影响。2营养干预法:低蛋白饮食和低能量饮食是建立FGR动物模型的常用方法，以采用低蛋白饮食法居多。 低蛋白饮食组孕鼠孕期饲以含5%8%蛋白的食物，对照组饲以含20%25%蛋白的食物4-6。低能量饮食是 指营养成分一致而实验组动物摄入食物总量低于对照组，中度者摄入对照组 50%的量，而重度者摄入 30% 的量，一般以对照组前Id的食物消耗量为基础计算限制组当天的食物量。此法操作流程简单，实际应用
5、 亦很方便。但要造成胎儿发病、又不至于发生流产或死胎，其营养素的供应量难以摸索。另外，准确把握 限制营养素的最佳时期也较为困难。3. 被动吸烟法：被动吸烟法是每天多次将点燃的香烟放入笼中，使孕鼠被动吸烟。吸烟可产生多种毒 性物质，它们均可降低胎盘灌流量及血液携带能力，并通过胎盘累及胎儿。被动吸烟法建立 FGR 动物模 型的方法比较成熟，能很好的模拟临床实际情况，且建模成功率最高7，已经成为目前广泛使用的方法。 但是香烟烟雾中所含成分多而复杂，要判断各成份的具体作用就比较困难。4. 更生霉素法：腹腔注射更生霉素是建立 FGR 动物模型的另一种常用方法。更生霉素是一种周期性 非特异性抗生素类抗肿瘤
6、药物，其选择性地与DNA中的鸟嘌吟结合，抑制以DNA为模板的RNA多聚酶， 从而抑制RNA的合成，使蛋白质合成受阻。此法操作简便，且FGR发病率高。柯志勇等用此法研究时 FGR 发生率为 42.12%。5. 低氧法：低氧吸入可造成母体组织缺氧，可能影响胎盘血液供应等使胎儿生长发育不良。制造低氧IUGR模型所用氧气浓度有10%、14%和17%9，持续时间长短不一。6. 血小板活化因子(platelet activating factor , PAF)法：Thaete10采用给妊娠期的母鼠输入外源性血小板 活化因子的方法建立了大鼠的 FGR 动物模型。该研究同时发现，孕鼠血液中血小板活化因子水平的
7、升高 和 FGR 发病的严重情况存在一定的剂量-效应关系，即在一定限度内，随着血小板活化因子剂量的加大， 仔鼠体重减低更明显。但血小板及其活化因子在FGR发病中的具体作用及其相关机制尚不清楚。在上述模型中，用得最多的是动脉结扎法和营养干预法，限制蛋白质方法在国内应用较少，主要是因 饲料合成技术达不到要求。改良的子宫动脉结扎法使用频率也较高，但手术对对照组母体和胎儿的影响大， 对照组的出生体质量相对较轻。吸烟法主要是国内研究者使用，国外报道少。更生霉素是一种细胞毒性药 物，其毒副作用影响该种模型的广泛应用。低氧模型在制作低氧环境时要求较高，需要特殊的设备，使用 也受到限制。血小板活化因子法的机制
8、尚不明确，仍需进一步研究。(二)脑损伤模型1. 脑白质损伤模型基于 PVL 的主要病因11，脑白质损伤动物模型一般分为 3 大类：缺氧缺血模型、宫内感染/炎症反应 模型和兴奋毒性模型。1.1缺氧缺血模型：常见的模型动物有大鼠、绵羊、兔。最常见的是对生后1-5d的新生大鼠进行单侧 或双侧颈总动脉结扎，术后合并或不合并吸入低氧造模12-15；单侧结扎术多合并吸入5.6%-8%氧气 2-4h， 双侧结扎术多合并吸入6-8%氧气30-60min。其次，可采用子宫内缺血再灌注法，即对孕兔进行暂时性子 宫动脉血流阻断 16;或直接对胎羊进行颈动脉血流暂时性阻断造模 17。近年来有学者利用 3 硝基丙酸 (
9、3-nitropropionic acid, 3-NP)脑内注射模拟缺氧造成脑白质损伤18。3-NP是一种线粒体毒素，它不可逆的抑 制琥珀酸脱氢酶活性（复合体II）和三羧酸循环，破坏氧化代谢，造成组织缺氧，从而模拟缺氧效果。1.2 宫内感染/炎症反应模型：常见的模型动物包括大鼠、兔和绵羊，造模方法包括脑内和子宫内注射脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）或细菌、病毒回2】。由于LPS容易获得，不含杂质，目前多采用LPS造模。1.3兴奋毒性模型：常见的模型动物为大鼠和小鼠，采用脑内注射谷氨酸盐类似物鹅膏蕈氨酸（ibotenate acid, IA）或S-bromowillard
10、iine造模22,前者作用于大脑内NMDA和代谢型受体，而后者则作用于AMPA 和红藻氨酸盐受体。在缺氧缺血模型中以单侧或双侧颈总动脉结扎合并或不合并缺氧最常用，单侧颈总动脉结扎合并缺氧 方法操作简单，可重复性好，病死率低，但由于单侧大脑半球病变不利于进行神经行为学实验，故可用于 自身对照；双侧颈总动脉结扎合并或不合并缺氧术后大鼠体重和脑重增长幅度均低于对照组，同时脑白质 逐渐出现疏松变，小胶质细胞增生，后期发生液化性坏死灶、双侧侧脑室扩大，更适于进行神经病理学研 究以及药理学研究。采用 3-NP 脑内注射模拟缺氧的方法操作简单，可重复性好，病死率为零，但病变部 位局限在注射部位附近，不能模拟
11、脑白质弥散性病变，其应用前景仍需进一步观察。宫内感染/炎症反应模 型无论脑内注射还是宫内注射LPS均可造成与人类相似的脑白质病变，且其实验动物的病死率较缺氧缺血 模型低。但是，Poggi等23采用孕15d的Fischer334大鼠子宫颈内注射LPS 1mg/kg造模，胎鼠出生后对 其进行神经行为学观察，发现无论出生体重、反射、随意运动等与对照组均无明显差异，而神经病理学检 查有明显的脑白质损伤。Roberson等24采用生后26d的Fischer334大鼠脑内注射LPS 30120“g/kg从 注射后至生后21d及生后8周对其进行神经行为学观察与对照组无明显差异，而免疫组织化学检查提示脑 白质
12、损伤。说明单独使用LPS对大鼠造模有局限性。兴奋毒性模型是以化学损伤模拟人类脑白质病变，不 符合早产儿PVL的自然病理过程，但其操作简单，病死率低，多以小鼠作为模型动物，价格经济，有利于 进行药理学研究，对进一步发掘PVL的治疗方法有很大的帮助。2. 新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE）模型Yagar等25噌在2004年做过统计，在200多种新生丿儿HIE相关动物实验中，大鼠应用最广泛（29%）,接 着是猪（25%）和羊（20%）。在这些动物模型中新生大鼠被研究应用的最广泛，但是与脑白质损伤动物模 型不同的是，HIE模型动物日龄的选择
13、7日龄的大鼠进行实验，此阶段大鼠的大脑皮层神经分层完整，少突 胶质细胞已发育成熟，白质已有髓鞘形成，缺氧缺血损伤主要作用于神经元细胞，造成患侧的大脑皮层变 薄，神经元坏死，与HIE的病理改变相符。2.1经典法：Vannucci等26对生后7d大鼠麻醉后行左颈总动脉结扎术，术后恢复48h后置于氧浓度为 8%的密封容器中持续缺氧3.5h。该方法容易实施，在血流变化及细胞代谢紊乱等方面与出生时窒息情况很 相似。新生猪由于其脑发育成熟度接近新生儿，是近年来采用较多的制备i IBD的动物模型。常用的方法 是呼吸机辅助通气吸入低浓度氧造成缺氧，合并双侧或者单侧颈动脉结扎造成缺血27。其优点是: （ 1）生
14、后 7 d新生猪的脑发育成熟度与足月新生猪接近；（2）除了研究急性缺氧造成的脑损伤外，也能研究缺氧后中 枢神经系统的远期预后及神经行为的改变；( 3)由于新生猪体格相对较大，适合研究缺氧后的多脏器损害。2.2局部短暂脑缺血及再灌注法：Sola等爭对生后7d大鼠麻醉后电凝左侧大脑中动脉，再用夹子夹毕 左侧颈总动脉lh造成大脑局部缺血，lh后去除夹子，使左颈总动脉再通，从而诱导再灌注形成。该模型的 诱导过程与新生儿HIE的发病过程相似29，主要用于研究暂时性缺血诱导的单纯缺血(没有缺氧)及再灌 注损伤对新生鼠大脑的影响。2.3宫内缺氧缺血法：一种是对胎羊注射NO合酶抑制剂导致胎羊缺氧30；另一种是
15、阻断胎羊脐带 从而造成胎羊宫内缺氧缺血性脑损伤；还有向孕兔输7%二氧化碳的氮气10 min使其窒息后剖宫迅速取出 新生兔的方法32。经典法模型只结扎一侧颈总动脉，仅引起单侧大脑病变，而不能使全脑及全身其他系统一同受损， 因此不能造成临床上严重窒息后引起多器官损害，有一定局限性。应用胎羊宫内缺氧的方法可获取丰富的 神经生理学相关资料，适用于急性及亚急性的生理及代谢机制的研究，但是操作复杂，价格昂贵；而使孕 兔缺氧的方法操作简便易行，但是模型的可靠性仍待进一步验证。3. 胆红素脑病模型经典的方法是 1997 年，国内学者陈舜年等33建立的新生豚鼠经腹腔注射胆红素溶液制作胆红素脑病 模型的方法；后来
16、也有学者采用大鼠、仔兔经腹腔注射胆红素溶液制作胆红素脑病模型34。但是由于血脑 屏障功能状态的影响，该方法引出异常神经行为活动及脑组织黄染现象的稳定性欠佳。近年来有学者采用 新生大鼠小脑延髓池注射胆红素溶液的方法制作胆红素脑病的动物模型35。该方法受血脑屏障功能状态的 影响较小，可更直接地研究胆红素的神经毒性。(三)肺部疾病模型1. 肺出血模型司徒勋等36通过外源性五羟色胺(5-HT)气管滴入建立新生大鼠肺出血模型，浓度以1X10-5 mol/ mL 较为适宜。模型制作简便，重复性好，其中弥漫性肺出血占10 % 15 %。研究者认为肺出血可能为5-HT 气管滴入后导致急性缺氧，诱导内皮素-1(ET-1)分泌所致，因为ET-1参与肺动脉高压形成及增加毛细血 管通透性，内源性 ET-1 的升高是导致肺出血的重要原因。陈克正等37用低
