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1、目 录1. 临床微生物实验室(细菌室和真菌室)工作制度2. 真菌实验室的质控3. 细菌、真菌室污染物处理原则4. 真菌实验室的消毒5. 真菌实验室的灭菌6. 检验科真菌室检验项目7. 浅表真菌的收集及检查8. 真菌培养、药敏及鉴定9. 标本的收集10. 标本的显微镜检11. 真菌培养12. 病原性酵母菌常用鉴定方法13. 蠕行螨的取材及检查14. 疥螨的取材及检查15. 头虱的取材及检查16. 体虱的取材及检查17. 阴虱的取材及检查18. 常用培养基的制备真菌实验室的灭菌1. 玻璃器具的灭菌方法：（1）检查、接种真菌用过的玻璃器具如试管、平皿、载玻片、盖玻片、吸管等应高压蒸汽灭菌。 （2）灭
2、菌后，清洗内容物。 （3）再用清洗液浸泡，或用肥皂水刷洗。 （4）最后用流动水将清洗液或肥皂水冲洗干净，烘干备用。 （5）制备无菌培养基也可采用高压蒸汽灭菌。 （6）制备无菌的培养基、玻片、盖片最好采用干热灭菌，放入烘箱内，使温度逐渐上升至150-160度，保持2小时，关闭电源，使其缓慢冷却，如果采用高压蒸汽灭菌，应用多层报纸或棉垫包好、包严、以便取出后仍保持无菌。 （7）以灭菌的2周内有效，超过2周的应重新灭菌后方可使用2. 室内灭菌法： （1）40%甲醛熏蒸法：加热或在高锰酸钾中加入甲醛，是之放出甲醛气体，空间密封24小时，50gKMnO4+100ml甲醛。 （2）乳酸熏蒸法：2份乳酸加1
3、份水置于干锅内混均后，将干锅放在铁架台上，下面用酒精灯加热，空间密封24小时。 （3）紫外线照射：应分片照射，每次照射1-2小时。 3. 清洗液的配制法： 蒸馏水2000mg，重铬酸钾1000g，浓硫酸8000ml。真菌实验室的消毒1. 临床标本投入黄色医用垃圾袋中，统一焚烧处理。2. 实验室每天用84或健之素消毒桌面。3. 菌污染桌面或台面，用5%石炭酸溶液覆盖3-5分钟，切不可用水直接冲洗。4. 实验室每月消毒一次，用40%甲醛熏蒸法，每10-15平方米用50gKMnO4+100ml甲醛5. 定期用5%石炭酸液擦洗地面。6. 每天室内紫外灯照射1-2小时。实验室质控1. 每批培养基做好以后
4、要做无菌试验和生长试验。2. 每批培养基用标准菌株作质控。3. 没有参加室间质控的项目应做室间比对。4. 室内冰箱、温箱、水箱的温度每天观察并做记录，及时调整温度。5. 实验室应参加北京市或卫生部的室间质控。表浅真菌标本的收集及检测一、皮肤真菌的检测1.标本取材（1）酒精灯火焰灭菌钝刀（2）患者皮肤75%酒精擦拭消毒（外阴及龟头有溃疡面时需用生理盐水擦拭）（3）却才应用钝刀从皮肤损害的边缘向外刮取皮屑（4）将皮屑置于干净的载玻片上 2.标本的处理 （1）载玻片上加一滴10-20%KOH （2）盖上盖玻片（3）放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2-3次，不应使之三次沸腾，以免结晶（4）轻压盖玻
5、片驱逐气泡并将标本压薄（5）用棉签吸去周围溢液，置显微镜下镜检3.标本的显微镜检（1）先用低倍镜检查有无菌丝和孢子（2）用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等4.报告结果（1）见到真菌结果即报阳性（2）未见到真菌结果季报阴性二、甲真菌的检测1.标本取材（1）酒精灯火焰灭菌钝刀（2）患者甲75%酒精擦拭消毒（3）却才应用钝刀甲的标本应从变色、萎缩或变脆的部位采取，尽可能近端取材，且应包括全甲厚度，因为真菌仅限于甲板的下方，如甲板增厚应从其下方刮屑（4）将刮屑置于干净的载玻片上2.标本的处理 （1）载玻片上加一滴10-20%KOH （2）盖上盖玻片（3）放置片刻或微加热，即在火焰上
6、快速通过2-3次，不应使之三次沸腾，以免结晶（4）轻压盖玻片驱逐气泡并将标本压薄（5）用棉签吸去周围溢液，置显微镜下镜检3.标本的显微镜检（1）先用低倍镜检查有无菌丝和孢子（2）用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等4.报告结果（1）见到真菌结果即报阳性（2）未见到真菌结果季报阴性三、头癣的检测1.标本取材（1）酒精灯火焰灭菌钝刀（2）酒精灯火焰灭菌镊子（3）患者甲75%酒精擦拭消毒（4）却才应用钝刀头皮的标本应从头皮损害的边缘向外刮取皮屑（5）用镊子拔取受损害的断发或毛发（6）将头皮刮屑或断发、毛发置于干净的载玻片上2.标本的处理 （1）载玻片上加一滴10-20%KOH （2
7、）盖上盖玻片（3）放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2-3次，不应使之三次沸腾，以免结晶（4）轻压盖玻片驱逐气泡并将标本压薄（5）用棉签吸去周围溢液，置显微镜下镜检3.标本的显微镜检（1）先用低倍镜检查有无菌丝和孢子（2）用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等4.报告结果见到真菌结果即报阳性 真菌涂片操作流程1. 标本取材皮肤、毛发、甲：酒精灯火焰灭菌钝刀，却才应用钝刀从皮肤损害的边缘向外刮取皮屑或用剪刀剪去疱顶。甲的标本应从变色、萎缩或变脆的部位采取，尽可能近端取材，且应包括全甲厚度，因为真菌仅限于甲板的下方，如甲板增厚应从其下方刮屑。毛发可用消毒后的镊子拔取标本或选取断发
8、。2. 标本处理 标本置于载玻片上加一滴10-20%KOH，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2-3次，不应使之三次沸腾，以免结晶。然后轻压盖玻片驱逐气泡并将标本压薄。用棉签吸去周围溢液，置显微镜下镜检3. 显微镜镜检先用低倍镜检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小、和排列等4. 报告结果 查见报告阳性真菌检查操作流程1、直接涂片镜检：标本取材直接涂片结果报告2、真菌培养、鉴定及药敏：标本取材直接涂片标本接种丝状真菌转种鉴别培养基如马铃薯培养基、皮肤癣菌培养基菌种鉴定；酵母菌接种显色培养基初步鉴定药敏试验结果报告一、直接涂片镜检1，标本取材2，标本
9、处理 标本置于载玻片上加一滴10-20%KOH，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2-3次，不应使之三次沸腾，以免结晶。然后轻压盖玻片驱逐气泡并将标本压薄。用棉签吸去周围溢液，置显微镜下镜检3显微镜镜检先用低倍镜检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小、和排列等二、真菌培养、鉴定及药敏1. 标本取材粘膜：应用无菌拭子取材。眼：灭菌小匙刮取溃疡部位。尿液：非插管病人取中段尿，标本应进行离心沉淀部分进行培养。下呼吸道标本：清晨新鲜的痰，采集后2小时之内处理，如不能及时处理应在4度冰箱内保存。脑脊液：3-5ml量是较为理想，标本离心。上清部分用于血清学试验
10、，沉淀部分由于培养也可镜检。其他体液标本：胸水、腹水和关节腔积液应收集于含有少量肝素抗凝（1：1000）的无菌容器中，标本离心沉淀部分培养。持续腹透的病人引流液应用不含肝素的无菌容器收集。脓：无菌注射器抽取，脓液中有颗粒应注意收集。骨髓：3-5ml抽取标本放入含有少量肝素抗凝（1：1000）的无菌容器中。组织：应放入灭菌生理盐水中，应尽可能自损害中心或边缘取材，有可能应全部切除小的皮肤损害、皮下或粘膜损害。2. 标本接种试管接种：酒精灯火焰加热接种环或接种针灭菌，试管在火焰上快速通过2-3次，打开试管塞，挑取少量标本，于沙氏的斜面中三点接种，试管口再次在火焰上快速通过2-3次，用胶塞封口。平板
11、接种：酒精灯火焰加热接种环或针，挑取少量标本接种于平板。3. 标本转种 根据标本鉴定需要某些菌种需要转种其他培养基，如皮肤癣菌培养基、马铃薯葡萄糖培养基。4. 菌种鉴定 根据不同菌种的生长特点（如生长速度、颜色、菌落大小等），镜检观察染色后（如乳酸酚棉蓝或苯胺蓝）菌丝及孢子的特点。5. 鉴定不清的菌种可采用PCR技术鉴定6. 真菌药敏试验酵母样真菌及丝状真菌药敏试验方法按照美国临床试验室标准化研究所（CLSI/NCCLS）指南进行操作和判读结果。方法有：稀释法和KB法E试验法按照说明操作，按照美国临床试验室标准化研究所（CLSI/NCCLS）指南判读结果。7. 结果报告报告种名常用真菌培养基一
12、、 沙氏培养基1. 成分：葡萄糖40g，蛋白胨10g，琼脂10g，蒸馏水1000ml，PH6.5-7.0。2. 制法：（1）葡萄糖及蛋白胨放入1000ml的三角烧瓶内。（2）把琼脂肪放在300ml的蒸馏水中溶解，用纱布滤过并补足1000ml蒸馏水倒入三角烧瓶内，封好。（3）8磅15分钟或10磅10分钟灭菌。（4）无菌操作分装如玻璃试管制成斜面。（5）4度冰箱中保存，使用半小时前取出，自制培养基保存不得超过一月。3. 用途：真菌培养的常规培养基二、 沙氏液基1. 成分：葡萄糖40g，蛋白胨10g，蒸馏水1000ml。2. 制法：（1）葡萄糖及蛋白胨、蒸馏水放入1000ml的三角烧瓶内，封好。（2
13、）8磅15分钟或10磅10分钟灭菌。（3）无菌操作分装在培养管或特殊容器中。（4）4度冰箱中保存，使用半小时前取出，自制培养基保存不得超过一月。3. 用途：分离白色念珠菌。可以提供完整菌落，为制备菌落素提供材料。三、 沙氏保存培养基1. 成分：蛋白胨10g，琼脂10g，蒸馏水1000ml。2. 制法：（1）葡萄糖及蛋白胨放入1000ml的三角烧瓶内。（2）把琼脂肪放在300ml的蒸馏水中溶解（3）用纱布滤过并补足1000ml蒸馏水倒入三角烧瓶内，封好。（4）8磅15分钟或10磅10分钟灭菌。（5）无菌操作分装如玻璃试管制成斜面。（6）4度冰箱中保存，使用半小时前取出，自制培养基保存不得超过一月
14、。3. 用途：菌种再次培养基上生长缓慢，可保存菌种用。四、 皮肤癣菌培养基1. 成分：蒸馏水1000ml，植物蛋白胨10g，葡萄糖10g，琼脂20g，酚红溶液40ml，0.8N盐酸6ml，放线菌酮0.5g，庆大霉素0.1g，金霉素0.1g。2. 制法：（1）植物蛋白胨、葡萄糖、琼脂加入1000ml水中，溶解（2）加40ml酚红溶液（酚红0.5g，溶于0.1N NaOH中加水至100ml）（3）加入6ml0.8N盐酸并振荡（4）放线菌酮0.5g溶于2ml丙酮中倒入热的培养基振荡。（5）庆大霉素0.1g溶于2ml水中，最后加入基液。（6）高压灭菌后，冷却到47度。金霉素0.1g溶于25ml水中，加入培养基。（7）分
