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1、抗菌药物敏感性试验与细节耐药性监测来源：检验医学在线2009-4-15 南网编辑2010-7-6一、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感试验 (一)纸片琼脂扩散法 纸片琼脂扩散法又称Kirby-Bauer试验，是操作最简易、使用最广泛的抗菌药物敏感性试验。 1试验原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC越小。 2培养基和抗
2、菌药物纸片 (1)培养基：水解酪蛋白(Mueller-Hin-ton，MH)培养基是CLSI/NCCLS采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，pH值为7.27.4，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。琼脂厚度为4mm。配制琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中4保存，使用前应将平板置35孵育箱孵育，使其表面干燥。 (2)抗菌药物纸片：选择直径为6.35mm，吸水量为20ul的专用药敏纸片用逐片加样或浸泡方法使每片含量达到规定所示。含药纸片密封储存28或-20无霜冷冻箱内保存，-内酰胺类药敏纸片应冷冻储存，且不超过l周。使用前将储存容器移至室温平衡l2h，避
3、免开启储存容器时产生冷凝水。 3细菌接种 细菌接种采用直接菌落或细菌液体生长方法。用0.5麦氏比浊标准的菌液浓度。校正浓度后的菌液应在15min内接种完毕。接种步骤如下：用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂片接种3次，每次旋转60，最后沿平板内缘涂抹1周；平板置室温下干燥35min，用纸片分离器或无菌镊将含药纸片紧贴于琼脂表面；置35孵育箱孵育1618h后阅读结果，对甲氧西林和万古霉素药敏感试验结果应孵育24h。 4结果判断和报告 用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径(抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域)，当葡萄球菌对苯唑西林的药敏试验或肠球菌对万古霉素的
4、敏感试验，围绕纸片周围只要有极少细菌生长提示为耐药。对另外一些菌，在抑菌圈内散在菌落生长提示可能是混合培养，必须再分离鉴定及试验，也可能提示为高频突变株。变形杆菌迁徙生长使抑菌圈内生成的薄层菌可忽略不计。由于培养基内抗药成分使其对甲氧苄啶引起的轻微细菌生长，生长层小于20可忽略不计。根据CLSI/NCCLS标准，对量取的抑菌圈直径判断病原菌对该药物的敏感性形式(敏感/中度敏感/中介、耐药)。 (二)稀释法 如果要进一步检测某种病原菌对多少剂量(浓度)的抗菌药物呈敏感时，就必须使用稀释法(dilution method)。稀释法包括两种：肉汤稀释法和琼脂稀释法，分别介绍如下： 1肉汤稀释法 有常
5、量稀释法(mac-rodilution)和微量稀释法(microdilution)，前者含药肉汤含量每管l.0ml(通常2m1)，后者每孔含0.1ml。商品化的微量稀释板上含有多种经对倍系列稀释的冻干抗生素，操作方便，广泛应用于临床。 (1)培养基：使用M-H肉汤，需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在该培养液中加入补充基质可支持流感嗜血杆菌、链球菌生长。培养基制备完毕后应校正pH值为7.27.4(25)。离子校正的M-H肉汤(CAMHB)为目前推荐的药敏试验培养液。(2)药物稀释药物原液制备：抗菌药物直接购自于厂商或相关机构，所需的溶液量或粉剂量可根据下述两公式进行计算。质量(mg)=溶
6、剂（ml）浓度（ug/ml）/分析效能（ug/mg）容积(m1)= 质量(mg) 分析效能（ug/mg）/浓度（ug/ml）配制各种抗菌药物的溶剂根据药物性能选择蒸馏水、pH值为6.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液等。 一般原液浓度不低于1 000ug/ml或10倍于最高测试浓度，原液应储存于-60以下，保存期不超过6个月。稀释抗菌药物的制备：行2倍系列稀释，使其终浓度(ug/m1)为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0、0.5、0.25、0.125等。 (3)菌种接种：配制05麦氏浓度菌液，用肉汤(常量稀释法)、蒸馏水或生理盐水(微量稀释法)稀释菌液，使最终菌液浓度(
7、每管或每孔)为5105 CFUml，稀释菌液于15min内接种完毕，35孵育1620h，当试验菌为嗜血杆菌属、链球菌属孵育时间为2024h，试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验孵育时间必须满24h以上。 (4)结果判断：以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC(ug/m1)。甲氧苄啶(甲氧苄胺嘧啶)或磺胺药物的肉汤稀释法敏感试验的终点判断，以细菌数为阳性对照的80即可作为判断细菌生长指标。微量稀释法时，常借助于比浊计判别是否有细菌生长。 2琼脂稀释法 琼脂稀释法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多头接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以
8、抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。 (1)培养基：M-H琼脂为一般菌药敏试验的最佳培养基，调整pH值在7.27.4(25)，过高或过低的pH值会影响药物效能。 (2)含药琼脂制备：将已稀释的抗菌药物按1：9(配制的药物溶液：琼脂培养基)加入，加热溶解琼脂，在4550水浴平衡融化MH琼脂中，充分混合倾入平皿，琼脂厚度为34mm。室温凝固后的平皿装入密闭塑料袋中，置28，储存日期为5d，对易降解药物如含头孢克洛，在使用48h之内制备平板，使用前应在室温中平稳放于孵育箱或层流罩中30min以使琼脂表面干燥。 (3)细菌接种：将0.5麦氏比浊度菌液稀释10倍，以多头接种器吸取(为12ul)
9、接种于琼脂表面，稀释的菌液于l5min内接种完毕，接种后置35孵育1620h(MRS、VRE孵育时间需满24h)，奈瑟菌属、链球菌属细菌置于5C02、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。 (4)结果判断：将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度(含甲氧苄啶平板上可见少许散在细菌生长)。试验菌的结果报告可用MIC(ug/mg)或用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)报告。 (三)E试验 E试验(Epsilometer test)是一结合稀释法和扩散法原理对细菌药敏试验直接定量的技术。 1试验原理 E试条是一条5mm50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，
10、浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。抗生素的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围，其斜率和浓度范围对判断有临床意义的MIC范围和分界点值具有较好的关联。 将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度(IC)，它与MIC呈高度相关。2细茵接种和加样使用厚度为4mmM-H琼脂平板，用0.5麦氏浓度的对数期菌液涂布，待琼脂平板完全干燥，用E试验加样器或镊子将试条放在已接种细菌的平板表面，试条全长应与琼脂平板紧密接触，试条MIC刻度面朝上，浓度最大处靠平板边缘。采用CL
11、Sl/NCCLS AST执行标准推荐孵育条件。 3结果判断和报告 读取椭圆环与E试验试条的交界点IC值。E试验IC值与CLSl/NCCLS的稀释法MIC参考值高度相关，二者直接相对应，CLSl/NCCLS MIC折点值适用于E试验。但在判断结果时出现和细菌、药物、耐药机制和技术处理有关判断问题时应予以修正。 二、苛养菌的药物敏感试验 肺炎链球菌及其链球菌属、流感嗜血杆菌、奈瑟菌属等苛养菌不能在普通环境及普通MH培养基中快速生长，上述的药敏试验条件不适合它们。它们需要更为复杂的培养基、孵育条件，在进行药敏试验时，质控菌株、药敏抗生素的选择、结果解释标准也有所不同。下面分别介绍几种重要苛养菌药敏试
12、验的试验条件选择、质量控制方法和结果判断注意事项。各自的结果判断标准请参考CLSl/NCCLS手册。 (一)嗜血杆菌属 1试验条件 (1)培养基：使用嗜血杆菌属试验培养基(hemophilus test medium，HTM)。 (2)接种菌液：菌悬液终浓度为5105CFU/ml。 (3)孵育条件：35下孵育2024h观察结果。对于扩散法，35、57C02下孵育l618h观察结果。 2质量控制 流感嗜血杆菌ATCC49247、流感嗜血杆菌ATCC49766、大肠埃希菌ATCC35218(用于-内酰胺抗生素/-内酰胺酶抑制剂)为推荐参考菌株。 3结果判断注意事项 (1)血液、脑脊液分离株仅需做氨
13、苄西林、三代头孢菌素中的一种、氯霉素和美罗培南。 (2)耐氨苄西林和阿莫西林的流感嗜血杆菌大多产TEM型-内酰胺酶。大多数情况下，直接检测-内酰胺酶更快。 (3)-内酰胺酶阴性而氨苄西林耐药(-Lactmase-negative，ampicillin-resistant，BL-NAR)的流感嗜血杆菌株少见。然而，不论其体外药敏试验是否出现敏感，均应考虑为阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、头孢克洛、头孢盂多、头孢尼西、哌拉西林/他唑巴坦耐药。 (二)肺炎链球菌 1试验条件 (1)培养基：肉汤稀释法使用离子校正的马冻融血培养基。 (2)接种菌液：菌悬液终浓度为l05CFU/ml。 (3)孵育条件：35下孵育2024h。 2质量控制 肺炎链球菌ATCC49619、大肠埃希菌ATCC35218(用于-内酰胺抗生素/-内酰胺酶抑制剂)为推荐参考菌株。 3结果判断注意事项 (1)对青霉素敏感者，均可认为对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林舒巴坦、头孢克洛等三代头孢菌素敏感；青霉素中介或耐药株，不推荐做上述药物的药敏试验，因为对青霉素耐药的肺炎链球菌对上述抗生素治疗的疗效很低。应当及时通知临床医生，然后应报告对头孢曲松、头孢噻肟和美罗培南的MIC。 (
