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1、酶标仪基本知识及其检测原理光是电磁波，波长100nm-400nm称为紫外光，400nm-780nm之间的光可被人眼观察到，大 子 780nm 称为红外光。人们只所以能够看到色彩，是因为光照射到物体上被物体反射回来。 绿色植物之所以是绿色，是因为植物吸收了光中的红色光谱。酶标仪测定的原理是在特定波 长下，检测被测物的吸光值。检测单位：光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测 物的浓度与被吸收的能量成定量关系。检测单位用OD值表示，OD是opticaldelnsity (光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光 密度，OD=10g (1/trans),其中tr
2、ans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则， OD 值与光强度成下述关系：E=OD=log 10/ I其中E表示被吸收的光密度，1 0为在检测物之前的光强度，1为从被检 测物出来的光强度。OD 值由下述公式计算：E=OD=CxDxE其中：C为检测物的浓度；D为检测物的厚度；E为摩尔因子。在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能 量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选 择特定的波长进行检测，称为测量波长。但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再 选取
3、一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收最小。检测波长 和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。Anthos 酶标仪检测值计算仪器中的检测器接收透过被检测物的光能量，转换成二进位数字信号，最大为4095.仪器定 义没有光源下的透光值为 0%，没有检测物的透光值为 100%。则实际检测中，检测物的透 光值均在 0%一 100%之间。透光值的计算如下：T=( Meas-Min) /( Max-Min)其中T为透光值，Meas为检测的二进位数值，Min为在0%的情况下检测的二进位数值， Max为在100%的情况下检测的二进位数值，举例如下：Anthos 酶标仪的中心定位 仪
4、器会自动对酶标孔进行中心定位，中心定位是要消除酶标孔底的凸凹引起的厚薄不均带来 检测的不准确。在对每一个酶标仪进行检测时，仪器其实要进行35 个点的测量，选取最中 间的5个点的均值为本孔的OD值。光源的参照通道参照通道是用来校准由于电压不稳或灯泡磨损带来的影响。酶标仪的用途和其它提示用于ELISA试剂的测定，广泛用于各种实验室，包括临床实验室。质量控制质量控制是试剂检测的重要因素。请按照试剂说明书的要求进行质量控制。空白校正有一些试剂盒的说阴书将空白孔设置为空气，其它大多数空白孔的设置是用试剂来设置的， 请按照试剂盒的说明书要求进行。检测结果的解释由于有相当多的因素会影响检测的结果，如不同的酶
5、标板，检测试剂的体积，都会造成OD 值的不，因此，只有使用同一酶标板反应的试剂检测结果才能比较和分析。对结果的临床解 释请依照试剂盒的说明书进行。酶标仪的使用注意事项1、工作环境酶标仪是一种精密的光学仪器，因此良好的工作环境不仅能确保其准确性和稳定性，还能够 延长其使用寿命。根据DINVDE0871条例，仪器应放置在无磁场和干扰电压的位置。依据 DIN45635-19 条例：仪器应放置在低于40分贝的环境下。为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。操作时环境温度应在15C-40C之间，环境湿度在15%-85%之间。操作电压应保持稳定。操作环境空气清洁，避免水汽，烟尘。 保持干燥、干净、水平的工作
6、台面，以及足够的操作空间。 2、操作注意事项 酶标仪的功能是用来读取酶联免疫试剂盒的反应结果，因此要得到准确结果，试剂盒的使用必须规范。许多医院在使用酶标仪之前是通过目测判断结果，操作过程随意性较大，在使用酶标仪后如果不能及时纠正操作习惯，会造成较大误差。在酶标仪的操作中应注意以下事项 使用加液器加液，加液头不能混用。洗板要洗干净。如果条件允许，使用洗板机洗板，避免交叉污染。 严格按照试剂盒的说明书操作，反应时间准确。在测量过程中，请勿碰酶标板，以防酶标板传送时挤伤操作人员的手。 请勿将样品或试剂洒到仪器表面或内部，操作完成后请洗手。如果使用的样品或试剂具有污染性、毒性和生物学危害，请严格按照
7、试 剂盒的操作说明，以防对操作人员造成损害。如果仪器接触过污染性或传染性物品，请进行清洗和消毒。 不要在测量过程中关闭电源。对于因试剂盒问题造成的测量结果的偏差，应根据实际情况及时修改参数，以达到最佳效果 使用后盖好防尘罩。出现技术故障时应及时与厂家联系，切勿擅自拆卸酶标仪。酶标仪及洗板机选购指南酶标仪(MicroplateReader)是对酶联免疫检测(EIA)实验结果进行读取和分析的专业仪器。酶联免疫反应通过偶联在抗原或抗体上的酶催化显色底物进行的，反应结果以颜色显示，通 过显色的深浅即吸光度值的大小就可以判断标本中待测抗体或抗原的浓度。酶标仪广泛地应用在临床检验、生物学研究、农业科学、食
8、品和环境科学中，特别在近几年 中，由于大量的酶联免疫检测试剂盒的应用，使得酶标仪在生殖保健领域中应用越来越广泛， 同时促进了生殖健康技术水平提高。目前国内许多计生站系统开展了酶免检测项目，如：乙肝五项、爱滋病检测、优生优育系列 检测、激素检测等。过去多数采用目测方法，报出的结果缺乏科学的依据。例如：某弓形虫 检测试剂盒中，临界值规定为：阴性对照品的OD值X2.5,通过目测无法判断标本孔的反应 颜色是否超过临界值。肉眼进行两孔之间的颜色比较可能还行，但比较一孔的颜色是否超过 另一孔颜色的2.5倍就不可能。国内多家权威机构，如卫生部临床检验中心和计划生育系统等多次强调酶标仪的重要性，并 要求酶联免
9、疫检测试剂应使用酶标仪判读，酶免试剂的质控也应使用酶标仪，并提供酶标仪 测定的原始数据，而各厂家的试剂盒说明书没有是让用目测的。同时酶免检测的项目往往是 一些实质性的感染和病变（如：肝炎、爱滋病、优生优育等），判读更要求严谨，由误诊引 起的纠纷很难处理。另外，住院手术病人术前的丙肝、爱滋等EIA试剂检测是避免因输血 引起感染引发的医疗事故纠纷的必要手段，正逐渐被许多单位所采用。我国免疫诊断方法主要有如下三种：酶免（EIA）、放免（RIA）和发光，在市场上的情况如 下：各种方法所处市场周期：放免衰退期，酶免成长期，发光进入期。放免技术由于试剂的污染和有效期等问题在国际和国内市场逐渐被淘汰，而化学
10、发光试剂和 设备比较昂贵，使得其在国内的普及特别在计生系统普及需要较长时间，EIA技术稳定，试 剂价格合理，供应充，酶免技术在中国市场处于成长期，因此购买酶标仪正合适宜。尤其要提到的是，在中国的计划生育和妇幼保健系统配备酶标仪已经迫在眉睫。早在几年以 前，世界卫生组织已建议对孕妇进行TORCH五项常规筛查，但是遗憾的是由于缺乏酶标仪 和洗板机等设备， RCH 的检测在中国还未能普遍开展。 TORCH 感染在围产医学中称为 TORCH综合症，由于孕妇，胎儿和新生儿都易被感染，它已受到全世界妇产科和儿科的极 大重视。妊娠期感染不仅危害母体，往往还可对胎儿和新生儿产生严重影响。通过胎盘可引起子宫内
11、感染而导致流产、早产、死胎或胎儿生长迟缓和畸形，通过产道和母乳可引起新生儿感染。 如累及神经系统可造成不同程度的智力障碍以及各种瘫痪、失聪ORCH感染与优生优育有 极为重要的关系。因此,RCH（IgG和IgM）检查通常也称为优生优育十项检查。目前,TORCH 的检测方法主要有放免（RIA）和酶免（EIA）。由于放免方法需要特殊仪器，且有放射危害， 目前正被酶免（EIA）方法取代。EIA方法具有特异性强，灵敏度高，简单快速，成本低等 优点，只要配备有酶标仪和其他相应的设备，多数普通实验室均可方便地开展。很显然，尽 快在计生系统普及酶标仪等设备是一个迫切的需求。这项工作的落实将有助于提高诊治水平，
12、降低母婴发病率，从而提高整个国民的健康素质。 目前市场上提供的EIA试剂越来越多，如：T3、T4、TSH、TORCH系列、不孕系列、各种 癌症标志物、伤寒、副伤寒等，另外通过母婴传播的性传播疾病（如淋病、梅毒、HIV）和 肝炎（如HBV、HCV）,以及胎儿的抗体，新生儿TSH的测定，疫苗反应等，市场上也都 有成套 EIA 试剂盒供应。使用酶标仪有利于拓展检测项目，提高检测水平，其社会效益和 经济效益并举。酶标仪的使用方法 作为微孔板比色计的酶标仪，其基本功能不外乎一个比色测定，所不同的是在测定波长范围、 吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量测定软件功能等方面 的差异，
13、当然全自动酶免疫分析系统还具有自动洗板、温育、加样等功能。在临床实验室实 际工作中，实验人员在使用酶标仪进行测定操作时，有时难免会对酶标仪的一些性能指标产 生迷惑，甚至对酶标仪的应用产生错误的理解。如诸如使用酶标仪较用肉眼观察测定的阳性 率明显增加这样的问题。一、测定波长一般酶标仪的测定波长在400750nm或800nm之间，完全可以满足ELISA 的显色测定。目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶（HRP）, 底物通常为四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD）,其在过氧化氢溶液的存在下，经 HRP作用，分别氧化为2,2,-二氨基偶氮苯（DAB ）和联苯醌。当pH值
14、为5.0左右时，DAB 在450nm波长处有最大吸收，当pH值降为L 0时，最大吸收波长移至492 nm,同时摩尔消 光系数变大，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。 TMB 的氧化产物联苯醌在 波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，H:O:和TMB过量时，则形成蓝色的阳离 子根。降低pH,即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物 稳定90min.因此，450nm和492 nm两个波长是目前ELISA测定最常用的。各种酶标仪都配 有放置滤光片的可自动转换的部件，可以同时安装68片滤光片，所配备的滤光片均应包括 上述两个波长，有的酶标仪以490nm滤光
15、片替代492nm滤光片，影响不大。除了这两个基 本滤光片外，考虑到双波长比色的需要，还应有620nm或630nm或650nm和405nm波长 的滤光片，其他滤光片可根据自己的需要选择。有时，有的实验室希望用酶标仪作微量生化 测定，故酶标仪生产厂家对其生产的酶标仪扩展了紫外检测功能，此时需要一个340nm波 长滤光片。此时，酶标仪的测定波长范围就成为340-750nm或800nm。酶标仪有单波长和双波长检测功能有时使用者不知在什么情况下使用单或双波长检测。所谓 的“单波长”就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定； 而“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长即4
16、50 nm或492 nm进行比色测定外，同 时用对特异显色不敏感的波长如630 nm进行测定，酶标仪最后打印出来的吸光度则为二者 之差。630 nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板子上诸如指纹、灰尘、脏物等所 致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。二、测定的吸光度范围通常，酶标仪的吸光度测定范围在o 0-2.5之间即可以满足ELISA的测定要求。早期的酶标 仪可测定的吸光度一般在0-2.5之间，但现在基本上都做了拓宽，可达到3.5以上，并且能 保持很好的精密度与线性。如Labsystems公司Dragon Wellscan MK-2的吸光度测定范围为 0-3.5，而 Multiskan Ascent的吸光度测定范围（Abs）达0-4.0，在 0-4.0范围，线性误差不 超过2.0%，在0.3-3.0吸光度
