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1、半定量和实时定量 PCR 步骤实验原理：RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。 RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA 文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的 RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly（A）+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、 oligo（dT）或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两
2、步法RT-PCR 中，每一步都在最佳条件下进行o cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进 行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进 行。实验步骤：Trizol 法 RNA 提取步骤1、提取总RNA2、逆转录反应3、PCR反应以下实验步骤仅供参考：1 样品 RNA 的抽提 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒 后，15到30孵育2到3分钟。4C下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为
3、下层的红色酚氯仿 相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的 60%。 RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA， 混匀后15到30C孵育10分钟后，于4C下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在 管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用 DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4C下7000rpm离心5分钟。 RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在
4、室温空气中干燥5-10分钟。 溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40“用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的 RNA溶液保存于-80C待用。2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光 度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40卩g RNA/mlo样品RNA浓度（卩g/ml）计算公式为：A260 x稀释倍数x 40卩g/m 1。具 体计算如下：RNA溶于40 pl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495卩l的TE中，测得A
5、260 = 0.21RNA 浓度=0.21 x100 x40 pg/ml = 840 pg/ml 或 0.84 pg/pl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 pl,剩余RNA总量为：35 pl x 0.84 pg/pl = 29.4 pg 纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60C,10 ml的10x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37%甲醛溶液（12.3 M）。lOxMOPS电泳缓冲液浓度 成分O.4M MOPS， pH 7.OO.1M 乙酸钠O.O1M EDTA灌制凝
6、胶板，预留加样孔至少可以加入25 溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的 lxMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 准备 RNA 样品取3卩gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10卩g/m 1。加热至70C孵 育15分钟使样品变性。 电泳上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少23cm。 紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度 大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RN
7、A （tRNA和5S 核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和 其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更 高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3 样品 cDNA 合成 反应体系序号反应物剂量序号反应物剂量1逆转录buffer2卩15逆转录MMLV0.5卩12上游引物0.2卩16DEPC 水5卩13下游引物0.2卩17RNA模版2卩14dNTP0.1卩18总体积10山轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 混合液在加
8、入逆转录酶MMLV之前先70C干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加 逆转录酶0.5卩1, 37C水浴60分钟。 取出后立即95C干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80C待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（gactin）实时定量PCR 卩-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3卩1按10倍稀释（加水27卩1并充 分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。 反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10卩15Taq酶1卩12阳性模板上
9、游引物F0.5卩16阳性模板DNA5卩13阳性模板下游引物R0.5卩17ddH2O32.5卩14dNTP0.5卩18总体积50卩1轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系：序号反应物剂量序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10卩15Taq酶1卩12内参照上游引物F0.5卩16待测样品cDNA5卩13内参照下游引物R0.5卩17ddH2O32.5卩14dNTP0.5卩18总体积50卩1轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93C 2分钟，然后93C 1分钟，55C 2分 钟，共40个循环。5制备用于绘制梯度稀释
10、标准曲线的DNA模板针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系：序号反应物剂量序号反应物剂量110x PCR缓冲液2.5 ul5dNTP混合液3卩12MgCl2溶液1.5卩16Taq酶1卩13上游引物F0.5卩17cDNA1卩14下游引物R0.5卩18加水至总体积为25卩1轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（94C1分钟；55 C1分钟；72C1分钟）；72C延伸5分钟。 PCR产物与DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增 条带。 将PCR产物进行10倍梯度稀释：将PCR产物进
11、行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1x1010，依次 稀释至 109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6 待测样品的待测基因实时定量 PCR所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。体系配置如下：序号反应物剂量序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10卩15Taq酶2卩12上游引物F1卩16待测样品cDNA5卩13下游引物R1卩17ddH2O30卩14dNTP1卩18总体积50卩1轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93C2分钟预变性，然 后按93C 1分钟，5
12、5C1分钟，72C1分钟，共40做个循环，最后72C7分钟延伸。7 实时定量 PCR 使用引物列表引物设计软件： Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成 稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。PCR 实验步骤一、组织抽提：1. 取组织块50-100 mg用液氮在研钵中研磨成粉末2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol抽打匀浆3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打4. 冰上孵育5分钟5. 离心12,000g 4C 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管6加0.2 ml氯仿，震荡，冰
13、上孵育5分钟7离心12,000g 4C 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管&加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9离心12,000g 4C 5分钟 弃去上清液10. 加入1 ml 75%乙醇，震荡11. 离心7,500g, 4C,5分钟 弃去上清液12. 室温下使之变透明13. 加入DEPC处理水10ul-35ul溶解RNA（可保存在液氮或低温冰箱）14. 走RNA变性电泳观察18s, 28s条带，分光光度 计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度二、RT反应体系RT反应体系（第一步）：约20分钟RNA抽提物5ulRadome引物2ulRNA sin0.5ul1.65C 1
14、5分钟2.立即放入冰浴RT反应体系第二步）：约2小时RNA sin0.5ul10mM dNTP1ul5XRT缓冲液 4ul25mM MgCl24ulAMV逆转录酶3ul1. 37C 1.5小时2. 94C 5-10分钟3. 反应物保存于-20C或进行PCR三PCR反应体系1）、PCR反应体系：约4.5小时25mM MgCl22ulCDNA模板2.5ul10XPCR 缓冲液5ulddH2O34ul10mM dNTP1ulTaq酶0.5ul上下游引物10pmol/ul2.5ulX2轻质石蜡油50ul100ul1.94C 2分钟，55C 1分钟，72C 2分钟 为第一个步1个循环 2.94C 45秒，55C 40秒，72C 1分钟 为第二步30个循环 3.72C 10分钟4取出后4C 5分钟后-20C保存或走电泳2)、PCR反应体系：约5小时25mM MgCl2 3ul10XPCR缓冲液5ul10mM dNTP1ul上下游引物 10pmol/ul2.5ulX2CDNA模板 ddH2O Taq
