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1、文件名称咼效液相色谱法操作规程文件编码版本号01制订人审核人批准人制订日期审核日期批准日期颁发部门GMP办公室实施日期分发部门质量部变更记录变更原因及目的：1.中国药典版本的更新；2.生产能力的扩容；3.为了更好的执行药品生产质量管理规范目的：制订高效液相色谱法操作规程，明确其检查法的操作。依据：中华人民共和国药典2010 年版；中国药品检验标准操作规范2010 年版。范围：高效液相色谱法的操作。责任：质检室主任、化验员。内容：高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色 谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱 内，各组分在柱内被分离，并依次进入检
2、测器，由积分仪或数据处理系统记 录和处理色谱信号。1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和 色谱处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程” 定期检定并符合有关规定。1.1 色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用 非极性填充剂，以十八烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型 的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。正向色谱 系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子 交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映 异构体的分离通常使用手性填充剂。
3、填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合集团的表面 覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留 行为和分离效果。孔径在15nm （1nm=10A）以下的填料适于分析分子量小于 2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在310p m之间。粒径更小（约 2p m）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。使用微径柱时，输油泵的性能、进样体检、检测池体积和系统的死体积 等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当调整。当对其测定结果产 生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。以硅
4、胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40C，为改善分离效 果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60C。流动相的pH值应控制在28之间。当pH值大于8时，可使载体硅胶溶 解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键相易水解脱落。当色谱系统中需 使用 pH 值大于 8 的流动相时，应选用碱性的填充剂，如采用高纯硅胶为载体 并具有高表面积覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂 化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH值小于2的流动相时，应选用碱性 填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基 取代十八烷基键合硅胶填充剂，或有机-无机杂化填充剂等。1.2 检测器
5、 最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器， 其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电 化学检测器和质谱检测器等。紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液 的浓度有关，还与化合物的结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器 为通用性检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似 的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同 时记录待测物质的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的纯度检 查。紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一 定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与
6、待测溶液的浓度通常 呈指数关系，故进行计算时，一般需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相 应符合紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版二部附录W A）项下对 溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波 长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使 用含不挥发性盐组分的流动相。1.3 流动相 反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统（采用紫外末端波 长检测时，首选乙腈-水系统），如经试用不合适时，再选用其他溶剂系统。 应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度 缓冲液的流动相。由于 C 链
7、在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷18 基键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低 于 5%，否则 C 链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。18各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改 变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组 分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试 品并达到系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时，以组分比 例较低者（小于或等于 50%）相对改变量不超过30%且绝对改变量不超过 10%为限，如 30%相对改变量的数值超过 10%时，则改变量以1
8、0%为限。对于必须使用的特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品 种项下注明。2 系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子 等四个参数。其中，分离度和重复性尤为重要。按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液 或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统 进行适当调整，应符合要求。2.1色谱柱的理论板数（n） 用于评价色谱柱的效能。由于不同物质在 同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效的指标时，应指 明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论板数。在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规
9、定的内标物质溶 液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间 t (以分钟或R 长度计，下同，但应取相同单位)和峰宽( W )或半高峰宽( W ) ,按h/2n=16 (T/W) 2或n=5.54 (t /W ) 2计算色谱柱的理论板数。R R h/22.2 分离度( R) 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知 杂质的分离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分(内标物 质或其他难分离物质)的分离度，或将供试品或对照品适当的方法降解，通 过测定待测组分与某一降解产物的分离度，对色谱系统进行评价与控
10、制。无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定 的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外，待测组分与相邻共存物 之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式为R=2(t -t )/(W +W)R2 R1 1 2或 R=2(t -t )/1.70(W +W )R2 R1 1,h/2 2,h/2式中，t为相邻两峰中后一峰的保留时间；t为相邻两峰中前一峰的保R2 R1留时间；W、W及W 、W 分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。1 2 1,h/2 2,h/22.3 重复性 用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。采用外 标法时，通常取各种项下的对照品溶液，连续进样 5 次，
11、除另有规定外，其 峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 2.0%；采用内标法时，通常配制相当 于 80%、 100% 和 120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成 3 种不同 浓度的溶液，分别至少进样 2 次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不 大于 2.0%。2.4拖尾因子(T) 用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量 精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算 公式为T=W /2d0.05h1式中，W 为5%峰高处的峰宽；d为5%峰高出峰顶点至峰前沿之间的距0.05h1离。除另有规定外，峰高法定量时T应在0.951.05之间。 峰面积法测定时，若拖尾严
12、重，将影响峰面积的正确测量。必要时，应 在各品种项下对拖尾因子作出规定。3 测定法3.1 内标法按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶 液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入 仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高。按下式计算校 正因子校正因子（f）二（A/c ） /（A/c）s s R R式中，A为内标物质的峰面积或峰高；A为对照品的峰面积或峰高；c为s R s 内标物质的浓度； c 为对照品的浓度。R再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图， 测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量含
13、量（c ） =f A/（a，/c/ ）X X S S式中， A 为供试品峰面积或峰高； c 为供试品的浓度； A， 内标物质的峰X X S面积或峰高；c，为内标物质的浓度；f为校正因子。S采用内标法，可避免因样品前处理或进样体积误差对测定结果的影响。3.2 外标法按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液， 分别精密量取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶 液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量含量（ c ）=c （ A/A ）X R X R式中各符号意义同上。 由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分 或杂质含量时，以定量环或
14、自动进样器进样为好。3.3 加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法 时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各 适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述3.1 法计 算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实 测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保留 时间定位。其数值一并载入各品种项下。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成 与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度（以噪声水平 可接受为限）或进样量（以柱子不过载为
15、限），使对照溶液的主成分色谱峰的 峰高约达满量程的10%25%或其峰面积能准确积分通常含量低于0.5%的杂 质，峰面积的相对偏差（RSD）应小于10%；含量在0.5%2%的杂质，峰面积 的RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%。然后，取 供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另有 规定外，应为主成分色谱峰保留时间的 2 倍，测量供试品溶液色谱图上各杂 质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较， 依法计算各杂质含量。3.4 不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，若没有杂质对照品，也可采用不加校正因子的主成分 自身对照法。同上述3.3法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶 液和对照品溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主 成分色谱峰保留时间的 2 倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与 对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品 溶液的色谱图I,再记录等体积纯溶剂的色谱图II。色谱图I上杂质峰的总 面积（包括溶剂峰），减去色谱图II上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面 积。然后依法计算。3.5 面积归一法按各品种项下的规定，配制供试品溶液
