基因工程复习知识点

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1、质粒名称和大小、复制启动子、多克隆酶切位点MCS、选择标记基因16 C连接，37 C酶切凝胶电泳 pH8.0 带负电1. 基因工程：又称遗传工稈，是通指重组DNA技术的产业化设计和应用的流稈。 强调基因克隆、载体构建、遗传转化、性状表达与产品提取及纯化等全部过程。2. 基因操作技术：利用遗传重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将包 含目的基因、特殊载体在内的各种必需元件的DNA分子经过改造和重组后，转入另一受 体生物细胞内。3. 基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列。4. 核酸：由许多核苷酸单位通过3， 5-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的具有方向性的 长链状化合

2、物。5. 顺反子(基因同义词)：在反式构型中不能互补的各个突变型在染色体上所占的一个区域 称为一个顺反子。是一个必须保存完整才具有正常生理功能的遗传物质最小单位。6. 突变子(muton)：突变单位，基因内部有许多突变位点，突变后产生变异的最小单位。(最 小的突变单位为1 个碱基对 bp)7. 重组子(recon)：重组单位，基因内部有多个重组单位，不能由重组分开的最小单位。一个基因不是一个突变单位，也不是一个重组单位。8. 断裂基因(split gene)：指基因内部被一个或更多不翻译的编码顺序即内含子所隔裂。基因都可划分为转录区(转录起始点至转录终止子的区域)和调控区(位于转录起始点 5

3、上游，包括核心启动子、上游启动元件及增强子等序列)结构基因并非都是连续的，原核生物基因是连续的，而真核生物的基因是断裂的9. 内含子(intron):在成熟mRNA的片段中未反应出的DNA区段；10. 外显子(extron/exon) : DNA序列中被转录成为mRNA中的片段。基因中能变成核苷酸序列的是外显子，内含子不能。11. 核小体(nucleosome):在真核生物中，双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘 绕，从而形成特殊的串珠状结构。核小体结构属于DNA的高级结构。核小体是染色体的基本结构单位。12. 重叠基因(overlapping gene):两个或两个以上的基因共有一段D

4、NA序列的现象。13. 转座子(Transposon):又名转位子、跳跃基因(jumping gene)是一类DNA序列，它们 能够在基因组中通过转录和逆转录，或在内切酶(Nuclease)的作用下，在其他基因座上 出现。转座子的发现，证明了基因组并不是一个静态的集合，而是一个不断在改变自身构成的动 态有机体。14. 同源重组： 是指发生在 DNA 同源序列之间的重组。15. 位点特异性重组：指发生在特异序列之间的重组，仅见于噬菌体的基因组整合到细菌染 色体中的过程。16. 转座重组：是指不依赖于序列间的同源性而使一种DNA顺序插入另一种DNA顺序中的 重组，因此转座是一种可在染色体的不同区段

5、或不同染色体之间广泛发生的重组。又称 为复制重组。17. 基因组：是指细胞内遗传信息的携带者DNA的总体。18. 组蛋白（histones）：是指染色体中的碱性蛋白质，其特点是富含二种碱性氨基酸（赖氨 酸和精氨酸）。19. PCR （Polymerase Chain Reaction）：聚合酶链式反应的简称。PCR技术是一种在体外高效 快速扩增特定基因或DNA序列的方法。20. 电泳：带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的过程。21. 载样缓冲液（loading buffer）：待电泳的样品在点样前与之相混合的一种缓冲液。22. 载体（vector）：能携带外源基因进入受体细胞的运载

6、工具，且有完整的复制（及转录） 功能的DNA大分子。23. 克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，有复制子即可24. 表达载体（expression vector）:能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体，既有复制 子，更要有强启动子25. 穿梭载体（shuttle vector）:既可在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达26. 质粒（plasmid）:存在于微生物染色体外的小型环状双链DNA分子，基因工程技术中应 用最广泛、功能最强大、最易操作的载体。不相容性：同一细胞内不能同时存在两种质粒27. 穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）

7、:由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标 记，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体28. Ampr （氨苄青霉素抗性）29. Tetr （四环素抗性）30. MCS：载体上供外源基因插入的、具有多个RE单一酶切位点的片段，一般为人工拼接 而成31. 回文结构（palindrom）：以切割序列正中作为轴心，反转对称；同一单链以中心轴对折 可形成互补双链。32. 平末端：在识别序列的对称轴上进行切割；33. 粘（黏）性末端：在识别序列的两个对称点切割，产生末端带有单链尾巴的切口；34. 同裂酶：不同的RE有相同的识别特点，但切割位点不一定相同；35. 同尾酶：不同RE识别不同序列，但切

8、割后能产生相同的粘性末端，可以连接起来36. 酶单位（U）：在最适反应条件下1小时完全消化l“g标准DNA所需的酶量为1个单位37. 星活力： RE 在酶切反应条件改变后识别特异序列的特性降低的一种现象38. DNA连接酶（DNA ligase）：催化双链DNA中相邻碱基的5磷酸和3羟基间磷酸二酯 键形成的酶39. DNA聚合酶：催化dNTP聚合成DNA的酶，主要用于DNA的体外合成、探针标记等40. 基因重组：DNA分子间（目的基因和载体）发生共价连接形成重组DNA分子的过程。41. 转化：是指感受态的宿主细胞捕获（重组） DNA 分子的过程42.感受态细胞(competent cells)

9、：处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞1. 绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。2. 根据重复程度，可以将DNA重复序列分为三种类型：单一或轻度重复序列、中等重复 序列、高度重复序列。3. 组成染色体的化学成分：DNA、蛋白质，RNA。4. 蛋白质含量约为DNA的二倍，RNA含量很少,还不到DNA量的10%。5. 组成染色体的蛋白质分为组蛋白和非组蛋白。6. 染色体外DNA：线粒体DNA、叶绿体DNA、质粒DNA7. CTAB (溴化十六烷三甲基铵)，可与多糖、变性蛋白质等结合，提取核酸时除去多糖、 脂类等杂质8. pUC18,拷贝数可达500-700个;携带抗氨芐青霉素基因

10、，转化细菌后含pUC18能生长； 还携带细菌lacl和lacZ基因编码，使菌落呈现蓝色；如果在lacz 中间插入外源DNA，破 坏半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色，作为选择重组子的标记。9. 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高于琼脂糖凝胶电泳10. 载体按功能分为克隆载体、表达载体、穿梭载体；按来源分为质粒载体、噬菌体载体、 柯斯质粒载体、真核细胞克隆载体；按受体细胞分为原核生物载体、真核生物载体、植 物基因工程载体、动物基因工程载体11. 具有三种不同的构型：SC型(共价闭合环形DNA)、OC型(开环DNA)、L型(线性DNA)12B -半乳糖酶可分解无色的化合物X-gal产生不溶性的蓝色分解物，

11、MCS在无外源基因插 入时不影响lacZ 基因表达；插入了外源基因的MCS影响lacZ基因表达，无0 -半乳糖 酶产生。因此在含X-gal的琼脂平板上，含非重组质粒的菌菌落是蓝色的、重组菌菌落 是白色的13. II型限制性内切酶的应用价值最大。II型酶只具限制活性，无甲基化修饰活性；对DNA 的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确；此类酶作用时只需要Mg2+参与，无需 ATP14. DNA连接酶主要类型有T4噬菌体DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、T4噬菌体RNA 连接酶基因工程(Geneengineering)遗传工程(Genetic engineering)转基因技术(Transgen

12、etechnology)基因操作技术(Gene opertation/Gene manipulation)分子克隆(M olecularcloning)基因克隆(Genecloning)基因重组(Gene recombination)突变子(muton)重组子(recon)断裂基因(split gene)内含子(intron)夕卜显子(extron/exon)核小体(nucleosome)重叠基因(overlapping gene)转座子(Transposon)内切酶(N uclease)同源重组(homologous recombination)位点特异性重组(site-specific r

13、ecombination)PCR(Polymerase Chain Reaction)Taq-DNA 聚合酶(Thermus aquaticus) 多克隆位点 (Multiple cloning sites,简称 MCS)分离纯化核酸的原则和要求： 应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。 核酸制备时的注意事项： 尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 尽量减少化学(化学试剂等)、物理(机械剪切力、高温等)和生物(核酸酶等)因素对 核酸的影响。如果提取的是DNA,则需要抑制DNase活力，同时还要防止机械张力拉断。金属离子螯合剂(如EDTA或柠檬酸钠)、去垢剂(如SDS)、蛋白变性剂(如苯

14、酚、氯仿) 都也可使 DNase 失活核酸制备中常用酶DNase:降解 DNARNase:降解 RNA蛋白酶K：去除蛋白质溶菌酶：溶解纟细胞壁(尤其是革兰氏阳性菌)核酸的保存保存温度:-70C长期保存的良好温度-20C也可较长时间保存4C 短期保存保存介质：TE 缓冲溶液最常用，首选；水-短期保存可用质粒DNA提取溶液I组成：葡萄糖、EDTA、溶菌酶葡萄糖：增加溶液黏度，防止菌体沉淀和DNA机械损伤EDTA：抑制DNAase，有利于溶菌酶作用溶菌酶：水解细胞壁(尤其是G+菌)溶液II组成：NaOH、SDSNaOH：溶解细胞、核酸在pH12或V3时会因H键解离而变性，0.2mol/LNaOH会使

15、溶液 pH 至 12.6SDS :溶解膜蛋白破坏细胞膜、使蛋白质变性沉淀溶液III组成：KAc (pH 4.8)使溶液pH回至中性，质粒DNA复性高浓度K盐的存在，置换了 SDS上的Na盐而形成PDS,有利于大分子染色体DNA、RNA以 及蛋白质凝聚而沉淀。溶液丨要加RNAase （如果提取的是RNA，则应该加DNAase），葡萄糖让DNA重悬（可加溶 菌酶，蛋白EK,破壁）溶液II：碱变性，让细胞裂解，让蛋白质，基因组DNA变性溶液III:酸复性，醋酸钾，蛋白质，基因组DNA复性不了，只有质粒DNA复性可能问题及解决办法1、DNA样品不纯混有多糖、蛋白等重新纯化 DNA有金属离子残留增加 70乙醇洗涤的次数（2-3 次）DNA溶解前有乙醇残留一一重新沉淀DNA，让乙醇充分挥发2、DNA降解材料不新鲜或反复冻融新鲜避免反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性可增加裂解液中螯合剂的含量 操作过于剧烈，DNA被机械打断一一细胞裂解后的操作应尽量轻柔 外源核酸酶污染所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 反复冻融将DNA分装保存于缓冲液中3、DNA提取量少实验材料不佳或量少尽量选材新鲜 破壁或裂解不充分延长处理时间和